* 本篇特別邀請原文通訊作者陳振輝老師審稿
在動物界中，表皮細胞的集體細胞遷移（collective cell migration）與胚胎發育[1]、傷口癒合[2]、癌細胞侵入的進程都習習相關。其中，蠑螈（salamander）、斑馬魚（zebrafish）等再生能力強的動物，在失去不同比例的附肢後，長回完整附肢的時間卻很接近，讓科學家們對於動物如何偵測被截的位置，並根據這個訊息影響組織再生速度的機制產生好奇。
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中央研究院細生所陳振輝副研究員團隊在2023年6月發表於 Nature Physics 的文章裡，對斑馬魚尾鰭（tail fin）再生的第一步──傷口癒合做研究。這個過程又稱作表皮再生（re-epithelialization），其中表皮細胞會在未增殖（non-proliferation）的情況下快速地動到幾小時內覆蓋傷口以避免感染。實驗的一開始，作者們用刀片將斑馬魚的尾鰭割出一個固定位置的傷口，並用共軛焦顯微鏡拍攝三維、有時序的影像，觀察基底表皮細胞（basal epithelial cells，BECs）的移動情形。這些 BECs在傷口出現的一到兩小時之間，會遷移到傷口表面，且持續累積直到形成一個突起（圖一 A）。除此之外，會遷移的細胞和傷口的距離與遷移開始的時機非常相關：距離傷口越遠的細胞會越晚開始移動，且在一段時間後，會從距離傷口最近的位置開始停止細胞遷移。距離傷口比較遠的細胞會被已經移動的細胞拉伸，讓其被活化並且開始跟著移動，因此產生了與「波」非常相似的動態。
圖一、A: BECs （白色細胞核標定）在截斷後移動的情形。低細胞密度的區域隨時間向尾鰭的近側出現，且細胞遷移後會使得尾鰭的遠側形成一個突起。B:前後時間點影像的像素相減之後，顯示有移動的區域，也就是紅色框出的 CMZ區域。如文中所述，在 50 到 60 分鐘之間形成了兩個 CMZ。C: 將白波的像素隨時間變化重組成一張平面圖（kyomograph），用於量化 CMZ 寬度（洋紅色CMZ length）、移動速率（青色斜率V_CMZ）、拉伸組織長度（stretch tissue length, 黃色L_stretch）等特徵。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
為了更瞭解這個「波」的特性，中央研究院物理研究所林耿慧研究員團隊進一步針對時序變化做了影像處理。利用前後兩個時間點影像的像素（pixels）進行相減，可以標示出時間點前後有移動的細胞，這些移動的細胞在影像處理後形成一塊白色的區域，被稱為細胞移動區域,（Cell mobilization zone，CMZ）（圖一 B）。對每個時間點之間的影像都作相應的處理之後，可以看到 CMZ 在 80 分鐘內的移動，這個動態被定義為「白波（white wave）」。為了要量化這個動態，作者們將顯微影像分析成kymograph1，結果可以看到傷口形後，CMZ 會張一最大寬度，再慢慢縮小到消失。當傷口非常大的時候，甚至可以觀察到接續產生的第二個白波（圖一 C）。
注1圖說：魚骨間區域（inter-ray）在斑馬魚尾鰭的位置。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
注1: Kymograph是能夠呈現時間（x軸）與空間（y軸關係的一種作圖式。在文中kymograph是魚骨間區域（inter-ray）依照時序畫在同一個平面圖上，製作kymograph的最大的優點在於能夠透過斜率來量化出移動速率。其他kymograph的應用還有視覺化心臟跳動的規律性、呈現出細胞爬行時偽足的移動行為等等。
接下來，合作的作者們想要探討不同傷口位置與細胞遷移動態的關係，因此分別在斑馬魚尾鰭的遠側、中側和近側截切（圖二 A）。非常有趣的是，即使切除的面積差很多，CMZ 的移動速率也並沒有太大的變化（圖二 B），而是與拉伸組織長度、CMZ 的長度等有正相關（圖二 C, D）。這樣的結果顯示在傷口癒合中存在位置感知（positional sensing）。除此之外，對傷組織外加械張力mechanical tension）和抑制對機械力敏感的離子通道 Piezo1，都得到同樣的結論：尾鰭上的機械張力決定了機械波的移動速度。
圖二、A: 截斷位置的示意圖，遠側（DA, distal amputation）切下的比例是整個魚尾的30%；中側（MA, middle amputation）是50%；近側（PA, proximal amputation）是75%。 B: CMZ移動速率和截斷位置較無相關 C, D: 在近側截斷，拉伸組織長度較長，CMZ較寬，若在遠側截斷則相反。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
為了要確認訊號是由機械波傳遞，作者在尾鰭的兩處製造傷口，並觀察 kymograph 上的白波。從兩個傷口開始傳遞的 CMZ 不像化學訊號會在相遇後中和，而是在相遇後穿越彼此，在 kymograph 上形成一個交叉的圖形，像是干涉現象，符合機械波相遇時的特性（圖三）。
圖三、在尾鰭上製造兩個切口時，從尾鰭遠側遷移至近側與近側遷移至遠側的 CMZ 相互交叉形成 X-wave 的圖形。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
作者們除了用斑馬魚做生物實驗以外，還進行了電腦模擬以了解機械波如何被形成與傳遞。如圖四 A 所示，在這個物理模擬中， BECs 被視為相連的一維彈簧，作用在它身上的有彈簧的彈力（cell-cell, Fcci）、細胞自身的活動力（mobility, Fmi），受到外界環境的摩擦力（friction, Fdi），以及在傷口佈滿細胞之後限制遷移的力（constraint, Fbi）。作者引入了在近側與遠側間摩擦力和活動力梯度，成功在模擬實驗（in silico）中建立與生物實驗結果相同的 CMZ 動態：擴張到最大寬度後再次縮小到消失。針對摩擦力和活動力梯度不同方向的模擬，也符合實際在傷口兩側CMZ長度變化的實驗結果（圖四 B, C）。
圖四、A: 電腦模擬示意圖。每個細胞分別會受到彈簧的彈力（Fcci）細胞自身的活動力（Fmi，受到外環境的摩力（Fdi），以及在傷口佈滿細胞之後限制遷移的力（Fbi）。B 上: CMZ 往摩擦力梯度高或是活動力梯度低移動時的電腦模擬情形。B 下: CMZ 往摩擦力梯度低或是活動力梯度高移動時的電腦模擬情形。C: 如示意圖切口時的 CMZ 移動情形。灰階梯度代表在尾鰭近遠側的機械力梯度，與模擬的結果相符。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
最後，作者們也探討了這個機械波訊號的起源。在過往的觀察中，受傷組織在幾分鐘內就會累積過氧化氫（H2O2），因此作者們提出過氧化氫可能是截斷部位釋出的化學訊號。使用活性氧類（reactive oxygen species, ROS）的螢光染劑觀察受傷的尾鰭，發現 ROS 只會在傷口周圍累積，且濃度與截斷的程度正相關。使用過度表達（overexpresion）過氧化氫捕捉酵素（scavenger enzyme）的斑馬魚個體進行相同的實驗時，CMZ 的長度、BEC 的移動速度減少，CMZ 的移動速度卻沒有變化。這個改變進而造成了傷口癒合的速度差異：雖然此種轉基因的個體在二十餘天後仍然可以將尾鰭長回，但是再生的速度比野生型（wild type）稍慢。
圖、斑馬魚尾在不同的虛處被截，當切口離尾鰭根部越近，產生的 H2O2 就越多，集體細胞遷移的機械波傳播越遠，再生的組織就越多。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41567-023-02151-y
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總結而言，作者團隊觀察到斑馬魚在表皮再生的過程中，細胞會進行位置感知，並且將這個位置的訊號透過機械波傳遞。此研的方法，不僅用了共軛顯微鏡即時觀察斑馬魚尾鰭在被截斷之後的細胞遷移，還建立了一個數學模型，討論不同參數和假說下電腦模擬與生物實驗結果的差異，綜合解釋了化學訊號與機械力調控的先後關係，以驗證他們的科學假設。
結論：以生化與機械力共同引發在斑馬魚尾表皮的機械波反應。截斷尾鰭使表皮產生ROS誘導的集體細胞遷移，遷移的成因是機械張力與摩擦力使得細胞拉伸，且截斷位置與遷移距離有關。在傷口癒合後細胞才會進行增殖，完成組再生。圖片來源：第一作者Marco Pomida De Leon
為什麼要將一開始在傷口處產生的化學訊號轉化爲機械訊號傳遞呢？作者們認爲這樣的策略可以讓訊號以等速傳遞給距離傷口遠的細胞，而不會像化學訊號會在傳遞過程迅速減弱。除了斑馬魚的尾鰭以外，作者更推測這種機械訊號傳遞也存在於其它有再生能力的動物，或是胚胎原腸化（embryonic gastrulation）過程中。這些研究結果具有被應用在傷口處理與組織再生的潛力，這篇的研究方法也為以生物物理角度進行再生研究提供了新的觀點。
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Main Article:
De Leon, M.P., Wen, FL., Paylaga, G.J. et al. Mechanical waves identify the amputation position during wound healing in the amputated zebrafish tailfin. Nat. Phys. 19, 1362–1370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41567-023-02103-6
參文獻：
- Théry, M. Wave of migration. Nature Phys 8, 583–584 (2012). https://doi.org/10.1038/nphys2374
- Poleo, G., Brown, C. W., Laforest, L. & Akimenko, M. A. Cell proliferation and movement during early fin regeneration in zebrafish. Dev. Dyn. 221, 380–390 (2001). https://doi.org/10.1002/dvdy.1152
撰文｜葉禹彤
審稿｜陳振輝老師、劉又萱、蕭皓文
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