全球正面臨氣候變遷，許多環境因子變得更嚴苛，UV 光（ ultraviolet radiation）的暴露量上升便是其中一項重要的議題，過度曝曬 UV 光對生物是極度有害的[1]。不同物種在不同生活環境下都有演化出不同抵禦 UV 傷害的機制[2][3][4]。高海拔生物更尤其需要有阻隔 UV 光的能耐。本研究將以代謝體學及基因表現差異分析來揭開高海拔青蛙 N.parkeri 如何抵禦 UV 照射的神秘面紗。
作者研究了 N.parkeri 及其他 2 個低海拔的近親 （同屬的 N.phrynoides 及近親屬 Q.spinosa ）在面對強 UV 暴露會有什麼反應，他們將這三種青蛙置於高強度的人造 UV 光下，拍攝不同時間點的皮膚組織切片並分析定量皮膚組織傷害。發現未照射 UV 的情形下，N.parkeri 的真皮層很薄且細胞之間的連結非常緊密，照射 UV 後 N.parkeri 皮膚的腺體及緻密結締組織仍保持相對緊密且分層仍明顯，但在近親中則發現相對應的組織及腺體受損較嚴重且出現真皮層壞死的情形（圖一）。研究團隊也分析了 3 種青蛙的細胞氧化傷害修復的能力，發現 N.parkeri 能夠在 30 分鐘達到 100% 修復，而近親並無這麼好的清除效率。再者，代謝體的分析結果也顯示經過 UV 照射，在 N.parkeri 中，會分泌比較多黑色素 （melanin） 及抗發炎和修復傷口相關的神經傳導物質，而在近親中並沒有發生相同變化。
圖一 : N.parkeri 以及其較低海拔近親 Q.spinosa 與 N.phrynoides 暴露 UV 光前後的皮膚組織切片，N.parkeri 的真皮層部分（包含 Stratum spongiosum 及 Stratum compactum）比其他近親都來的薄，右邊 UV 曝曬後被橢圓圈起來的區域即受損的皮膚部分。圖片來源:https://doi.org/10.1073/pnas.2212406119
接著，作者進一步探討了基因與抵 UV 能，研究團隊利用了不同基因定序方式分析了 N.parkeri 的基因資料。作者利用 RNA 定序及轉錄體分析得到了不同基因簇，再透過共表現基因的分析與時間順序把N.parkeri 的基因表現形態大致分為 4 組：0.5 小時的早期上調 （early-phase up-regulatuion）、6-8 小時的晚期上調 （late-phase） 與 UV 照射過程中逐漸上升、UV 照射過程中逐漸下降（圖二）。
在早期上調一組中，與免疫系統及皮膚保濕相關的基因在 N.parkeri 中有上調並隨時間緩和下降的情形。N.parkeri 的免疫系統可以保護他們免於 UV 導致的免疫抑制，而皮膚保溼相關的基因則和神經醯胺（ceramide）的製造有關，這些基因能夠調控 UV 導致的氧化性壓力與角質細胞的增生。在 N.parkeri 的晚期上調組中，在發炎反應與細胞凋亡的調控的共同表達基因有顯著上升，另外，也發現製造組織胺 （histamine）相關的基因表現與抗氧化代謝體相關的共同基因表現都有上升的趨勢，這和代謝體分析的結果趨勢是一緻的。在UV照射過程中，與壓力調節與周邊神經調控相關的基因逐漸上升趨，和胞期有關的共表達基因量則是逐漸下降。
圖二 : A. 研究團隊給予 3 種青蛙的 UV 光暴露照射的時間點，分別有 0、0.5、1、2、4、6 及 8 小時。B. 將不同基因表現形態分為 4 組，左圖表為標準化後的個時間點之基因表達改變圖，圖中實現線為基因表達的平均值，右圖為基因表現的熱圖（heatmap）.圖片來源:https://doi.org/10.1073/pnas.2212406119
作者再來針對非編碼基因進行分析，探討 miRNA（小分子核糖核酸）的變化，miRNA 被認為是在逆境下調控 mRNA 的靜的物。一針對 3 個類的青蛙對先前的 4 個分組進行比較，並發現了在 N.parkeri 中有獨特的 miRNA表現，作者發現這些 miRNA 到照射 UV 光後 8 小時後才有明顯的改變，這也恰巧和發炎及免疫調節相關的基因上調的表現趨勢相反，另外一群 miRNA 也被發現可以促使細胞週期相關基因表達下降，由此可以知道 miRNA 有助於調控UV防禦相關的基因表現。
最後作者探討了在 3 個物種中基因及蛋白質序列差異和功能變化與選擇壓力的關聯。此處作者團隊以親緣關係圖呈現和UV抵禦相關的正向選擇基因（positive select genes; PSGs），其中酪胺酸酶（Tyrosinase）是在製造黑色素程中速率決定步驟的重要酵素，他們發現在 N.parkeri 中有 3 處的胺基酸變異，作者推測這樣的變異有助於提升酵素的親和力，經過實驗證實也符合假說，證實該基因和 N.parkeri 在 UV 照射下能產生更多黑色素的能力有關（圖三）。
這篇研究揭露了和 UV 抵禦機制相關的遺傳與演化資訊，並建立了研究青蛙 UV 抵禦機制的模型，也能夠為未來皮膚癌或抗 UV 相關機制的研究提供新的方向。
圖三 : A.其中一個PSG-TYR的蛋白質序列替換及親緣關係樹。B.探討TYR在N.parkeri及近親青蛙的酵素活性。 圖片來源:https://doi.org/10.1073/pnas.2212406119
Main Article:
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撰文｜黃淵揚
審稿｜葉國掄
