miR-34a 是什麼?
miR-34a 屬於 miR-34 家族的一員，受著名抗癌基因 p53 的調控，影響細胞增殖（cell proliferation）、移動（migraton）、侵入（invasion）、細胞凋亡（apoptosis）與免疫逃脫（immune evasion）等。在多種癌症中，都可見到miR-34a的表現量減少[1] [2]。
常用的修飾方法
常見的 RNA 修飾方法可以分成兩大類（圖一）[3]：
- 核糖（ribose）的修飾：對核糖常見的修飾包含對於二號碳（2’）上修飾為甲氧基（-O-methyl）或氟基（-fluoro），修飾後的 RNA 可增加鹼基配對時的親和力（binding affinity）與抗核酸酶（nucleases）的能力。
- RNA 骨幹（backbone）的修飾：將 RNA 骨幹上磷酸的氧替換成硫後，可增進抗核酸外切酶（exonuclease）的能力。
圖一：RNA 的結構，與常見的 RNA 修飾方法。 圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8 、https://doi.org/10.1039/C2CP41987D
本篇文章的 RNA 修飾設計
雖然對於 RNA 的修飾可以增進其穩定性、減少降解量，但過多的修飾卻可能影響原本的作用機制。例如過強的親和力，可能影響 RNA 誘導型緘黙化複合體（RISC, RNA-induced silencing complex）解開雙股結構（unwinding）等能力。
本篇文章中，研究團隊使用了22 個核苷酸對 15 個核苷酸的非對稱設計，使單股 RNA 維持穩定的同時，RISC 仍能夠輕易地解開雙股 RNA 與置換序列（strand displacement）（圖二）。
圖二： 上圖：本文提出的 FM-miR-34a（全修飾的 miR-34a ）與已商業化 PM-miR34a的比較。 下圖： PM-miR-34a 兩股核苷酸數相近，而作者提出的全修飾 FM-miR34a 兩股核苷酸相差較大，這樣的股數差異反映在電泳結果上。 圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
為了驗證修飾後 miR-34a 的穩定性，作者將不同修飾程度的 miR-34a 浸泡在 50% 血清（serum）中，結果顯示FM-miR3-4a（全修飾的 miR-34a ） 具有較高的穩定性；UM-miR-34a（未修飾的 miR-34a）、與PM-miR-34a（部分修飾的 miR-34a）在浸泡 50% 均降解、在電泳跑膠會出現較多較小的鹼基數（圖三）。
圖三：在浸泡 50% 血清 0.1、1、6、12 和 24 小時後，UM-miR-34a（未修飾的 miR-34a）、PM-miR-34a（部分修飾的 miR-34a）與 FM-miR3-4a（全修飾的 miR-34a ） 的凝膠電泳結果。 圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
細胞實驗驗證：從基因到細胞表現
一、FM-miR-34a 具有基因靜默效果。
為了檢驗不同修飾的 miRNA 基因靜默效果，該團隊在 miR-34a 感測基因的下游連接了一段螢光素酶（luciferase），當 miR-34a 作用而發生基因靜默時，螢光就會減少（圖四）[4]。實驗結果顯示 PM-miR-34a 與 FM-miR-34a 都能引起基因靜默。該團隊也檢測了不同癌症細胞株的癌症標記基因，如MET、CD44，與 mRNA AXL、MET、SIRT1 的表現，發現 FM-miR-34a 與 PM-miR-34a 一樣能減少這些基因的表現。
圖四： 左圖：使用螢光素酶做 reporter 的實驗設計 右圖：螢光量化結果。FM-miR-34a 與 PM-miR-34a 螢光相比控制組（NC）都減少，顯示有基因靜默發生。 圖片來源： https://doi.org/10.1007/978-1-61779-083-6_11、 https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
二、比較總轉錄本（Transcriptome）的抑制效果
FM-miR-34a 與 PM-mi-34a 具有相似的抑制效果，且 FM-miR-34a 的效果更強。
三、細胞增殖
此階段分為兩階段進行：首先使用癌細胞株檢驗 miR-34a 抑制細胞增殖與入侵的影響。FM-miR-34a 與 PM-miR-34a 都有抑制的效果，且這個效果僅存於癌細胞株，對正常細胞株沒有影響（圖五）。
圖五：PM-miR-34a 與 FM-miR-34a 相比控制組，可抑制癌細胞株增殖。 圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
第二部分則是將這些癌細胞株植入動物體中，觀察腫瘤的發展，結果顯示 FM-miR-34a 腫瘤發展較慢且較小（圖六）。
圖六：PM-miR-34a 與 FM-miR-34a 相比控制組，在小鼠異種異位移植實驗上，FM-miR-34a 有較好的抑制效果，腫瘤較小且發展較慢。 圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
四、機制驗證
為了確認FM-miR-34a 與原生 miRNA 使用同樣的 RISC 機制，作者們首先使用了免疫沉澱法（immunoprecipitation）沉澱 RISC 的主成分 Argonaute （Ago）後，在對其進行 qPCR 的量化，結果顯示 miRNA 均有成功與 Ago 結合並一同沉降（圖七）；其次，作者在 Ago2 剔除（knock-down）的背景下檢視 FM-miR-34a 的基因靜默效果，結果顯示 FM-miR-34a 的作用需要 Ago2 的存在，顯示 FM-miR-34a 的作用機制與原生 miRNA 相似[5]。
圖七： 左圖：免疫沉澱法（immunoprecipitation）沉澱 RISC 的主成分 Argonaute （Ago）後，可將產物進行近一步的分析，如圖中的電泳、或本文使用 qPCR 進行量化。 右圖：量化結果顯示相比非特異性的 IgG 控制組，使用 Ago2 抗體沉澱的 RISC 上，均可以偵測到 miR34a、 PM-miR-34a 或 FM-miR-34a 片段，代表這些 miR-34a 們都有結合到 RISC 上。 圖片來源： https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7540-2_11 、https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
動物實驗驗證
在動物實驗中，如何準確傳送 miRNA 至癌細胞成了另一個問題。
利用癌細胞會大量複製、需大量葉酸合成、會表現較高葉酸受體（folate receptor, FR）的特性，研究團隊將 miRNA 與葉酸（folate）連接在一起， miRNA 能與葉酸一同帶入癌細胞內，上演一齣木馬屠城記。結果顯示 FM-miR34a 能抑制腫瘤的生長；檢視基因表現亦可發現MET、AXL、與 CD44 等癌症基因顯著減少。安全性上，老鼠的體重並沒有顯著改變，顯見此傳遞策略並沒有影響正常細胞（圖八）。
圖八：在裸鼠上殖入帶螢光素酶的細胞作為 reporter，測試 miRNA 連接葉酸的傳遞效果。結果顯示 FM-FolamiR-34a （連接葉酸的全修飾 miR-34a ）相比 PM-FolamiR-34a （連接葉酸的半修飾 miR-34a ）與控制組，有較小的腫瘤與螢光量。 圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
本篇文章透過從細胞到動物實驗的驗證，研究團隊展示了其全修飾、雙股不對稱的 miRNA 設計與藥物傳遞策略，可以增進 miRNA 的穩定性、有效傳遞到癌細胞、並提升抗腫瘤效果，為 miRNA作為抗癌藥物的發展，開啟了新的想法與可能。
Main Article:
Abdelaal, A. M., Sohal, I. S., Iyer, S., Sudarshan, K., Kothandaraman, H., Lanman, N. A., Low, P. S., & Kasinski, A. L. (2023). A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene, 42(40), 2985–2999. https://doi.org/10.1038/s41388-023-02801-8
參考文獻：
1. Hermeking H. (2012). MicroRNAs in the p53 network: micromanagement of tumour suppression. Nature reviews. Cancer, 12(9), 613–626. https://doi.org/10.1038/nrc3318
2. Zhang, L., Liao, Y., & Tang, L. (2019). MicroRNA-34 family: a potential tumor suppressor and therapeutic candidate in cancer. Journal of experimental & clinical cancer research : CR, 38(1), 53. https://doi.org/10.1186/s13046-019-1059-5
3. Šponer, J., Mládek, A., Šponer, J. E., Svozil, D., Zgarbová, M., Banáš, P., Jurečka, P., & Otyepka, M. (2012). The DNA and RNA sugar-phosphate backbone emerges as the key player. An overview of quantum-chemical, structural biology and simulation studies. Physical chemistry chemical physics : PCCP, 14(44), 15257–15277. https://doi.org/10.1039/c2cp41987d
4. Tomasello, L., Cluts, L., & Croce, C. M. (2019). Experimental Validation of MicroRNA Targets: Luciferase Reporter Assay. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1970, 315–330. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9207-2_17
5. Yi T. (2018). Identifying RISC Components Using Ago2 Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1720, 149–159. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7540-2_11
撰文｜連盟家
審稿｜林書岑
