單細胞基因定序被 2013 年 Nature 期刊訂為年度技術。其重要性在於能檢視單一細胞的基因體，以評估細胞之間的基因體異質性對於該組織或者疾病的貢獻。此技術的出現，對於基因突變累積為主要致病原因的癌症來說，橋接了基因到細胞的層次，也回答細胞間基因異質性程度與癌症各期發展間的相關性。這篇小新聞中，主要焦點會集中在現行用來分離細胞以及放大基因組的各種技術，並且利用此技術可回答的生物問題。
一．分離細胞
如何分離單一細胞是最重要的步驟，目前常見的方法有：顯微操作（micromanipulation）、雷射顯微擷取系統（laser capture microdissection, LCM）、流式細胞儀（圖 A）。顯微操作法雖然較簡單且價格低廉，但缺點是需要新鮮的懸浮細胞且低產量。相形之下，雷射顯微擷取系統可以應用在固定的組織以及冷凍切片上，並且額外可以獲得細胞在組織上空間分佈的資訊，但同樣的有著低產量的特性。流式細胞儀則是有著最佳的速度以及篩選細胞的產量，並且搭配免疫方法進行標定來篩選出特定的細胞。另外，針對熱門的散播癌細胞（circulating tumor cells, CTCs; disseminated tumor cells, DTCs）、癌幹細胞（cancer stem cell, CSCs）等，利用散播癌細胞的大小（> 7 μm）大於白血球（< 7 μm）的特性，可以利用加裝在微流道系統的粒子過濾器予以分開。而哈佛大學研究團隊甚至整合放大單細胞基因的技術至微流道系統，同時處理了分離細胞以及放大基因組（詳情請參考： 結合微流道與條碼 · 解析單一細胞基因表現）。
二．如何放大單細胞的基因組卻不至於失真
最常用的方法是 degenerative oligonucleotide primed PCR（DOP-PCR）, 主要是利用基因組出現頻率高的特定序列（common sequence）當作引子，進行 PCR 放大。然而，此種方法的缺點是使用頻率較高的特定序列當引子，並不代表該特定序列在基因體上的分佈密度是均勻的，因此侷限了基因組定序的涵蓋範圍（coverage breadth，圖 C）。為了改善涵蓋範圍的限制，multiple displacement amplification（MDA）使用了混合所有可能性的亂數引子團（常用的長度為六個鹼基），並搭配會產生分支的 Phi29 聚合酶，大大提升了基因組定序的涵蓋範圍；然而，MDA 也因此有較高的 allelic dropout rate（ADO， 圖B）。2012 年，由哈佛大學 Sunney Xie 領導的團隊改善了這個缺點，推出了 MALBAC 方法，同時也維持了高度的覆蓋率，雖然缺點為使用錯誤率較高的合成酶，但可用定序多顆細胞來降低錯誤率。
單細胞基因定序在細胞層次上，描繪出細胞種系的演化親緣圖，例如在白血病的病患，其突變的亞系基因組是可以上溯至共同的始祖細胞。此外，單細胞基因定序，更準確地修正癌細胞的突變速度是一般細胞十三倍左右。提高單細胞基因定序的精確性仍然是單細胞基因定序努力的方向，相信科學界也相當期待利用此技術，以生態系的觀點看待組織及癌症能夠在未來激出什麼火花。
參考資料：
- Gawad, C., Koh, W., & Quake, S. R. (2016). Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics, 17(3), 175-188. doi:10.1038/nrg.2015.16
- Navin, N. E. (2014). Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biology, 15(8). doi:10.1186/s13059-014-0452-9
- Adams, D. L., Martin, S. S., Alpaugh, R. K., Charpentier, M., Tsai, S., Bergan, R. C., … Cristofanilli, M. (2014). Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(9), 3514-3519. doi:10.1073/pnas.1320198111
圖片來源：http://goo.gl/TirvbQ
撰文｜邱亮源
審稿｜謝典戰
修訂｜藍冠鈞
