生物技術 科學報導

基因體學:一次定序一細胞

單細胞基因定序被 2013 年 Nature 期刊訂為年度技術。其重要性在於能檢視單一細胞的基因體,以評估細胞之間的基因體異質性對於該組織或者疾病的貢獻。此技術的出現,對於基因突變累積為主要致病原因的癌症來說,橋接了基因到細胞的層次,也回答細胞間基因異質性程度與癌症各期發展間的相關性。這篇小新聞中,主要焦點會集中在現行用來分離細胞以及放大基因組的各種技術,並且利用此技術可回答的生物問題。

一.分離細胞

如何分離單一細胞是最重要的步驟,目前常見的方法有:顯微操作(micromanipulation)、雷射顯微擷取系統(laser capture microdissection, LCM)、流式細胞儀(圖 A)。顯微操作法雖然較簡單且價格低廉,但缺點是需要新鮮的懸浮細胞且低產量。相形之下,雷射顯微擷取系統可以應用在固定的組織以及冷凍切片上,並且額外可以獲得細胞在組織上空間分佈的資訊,但同樣的有著低產量的特性。流式細胞儀則是有著最佳的速度以及篩選細胞的產量,並且搭配免疫方法進行標定來篩選出特定的細胞。另外,針對熱門的散播癌細胞(circulating tumor cells, CTCs; disseminated tumor cells, DTCs)、癌幹細胞(cancer stem cell, CSCs)等,利用散播癌細胞的大小(> 7 μm)大於白血球(< 7 μm)的特性,可以利用加裝在微流道系統的粒子過濾器予以分開。而哈佛大學研究團隊甚至整合放大單細胞基因的技術至微流道系統,同時處理了分離細胞以及放大基因組(詳情請參考: 結合微流道與條碼 · 解析單一細胞基因表現)。

二.如何放大單細胞的基因組卻不至於失真

最常用的方法是 degenerative oligonucleotide primed PCR(DOP-PCR), 主要是利用基因組出現頻率高的特定序列(common sequence)當作引子,進行 PCR 放大。然而,此種方法的缺點是使用頻率較高的特定序列當引子,並不代表該特定序列在基因體上的分佈密度是均勻的,因此侷限了基因組定序的涵蓋範圍(coverage breadth,圖 C)。為了改善涵蓋範圍的限制,multiple displacement amplification(MDA)使用了混合所有可能性的亂數引子團(常用的長度為六個鹼基),並搭配會產生分支的 Phi29 聚合酶,大大提升了基因組定序的涵蓋範圍;然而,MDA 也因此有較高的 allelic dropout rate(ADO, 圖B)。2012 年,由哈佛大學 Sunney Xie 領導的團隊改善了這個缺點,推出了 MALBAC 方法,同時也維持了高度的覆蓋率,雖然缺點為使用錯誤率較高的合成酶,但可用定序多顆細胞來降低錯誤率。

單細胞基因定序在細胞層次上,描繪出細胞種系的演化親緣圖,例如在白血病的病患,其突變的亞系基因組是可以上溯至共同的始祖細胞。此外,單細胞基因定序,更準確地修正癌細胞的突變速度是一般細胞十三倍左右。提高單細胞基因定序的精確性仍然是單細胞基因定序努力的方向,相信科學界也相當期待利用此技術,以生態系的觀點看待組織及癌症能夠在未來激出什麼火花。

參考資料:

  1. Gawad, C., Koh, W., & Quake, S. R. (2016). Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics17(3), 175-188. doi:10.1038/nrg.2015.16
  2. Navin, N. E. (2014). Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biology15(8). doi:10.1186/s13059-014-0452-9
  3. Adams, D. L., Martin, S. S., Alpaugh, R. K., Charpentier, M., Tsai, S., Bergan, R. C., … Cristofanilli, M. (2014). Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences111(9), 3514-3519. doi:10.1073/pnas.1320198111

圖片來源:http://goo.gl/TirvbQ

撰文|邱亮源
審稿|謝典戰
修訂|藍冠鈞

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邱亮源

凱斯西儲大學化學所博士班三年級。研究興趣是結構生物學及生物物理。希望透過investigator平台,能夠擴展視野,與來自不同生醫領域的朋友交流,並藉由撰寫科普文章,為推廣生醫研究盡一份心力。