深度學習輔助抗蛇毒研究：設計新型抗蛇毒蛋白

蛇咬傷是全球公共衛生領域中經常被忽視的危機。根據世界衛生組織（WHO）統計，每年約有 540 萬人遭蛇咬傷，主要發生在非洲、亞洲及拉丁美洲的熱帶與亞熱帶地區，其中以農村居民受害最深 [1]。在台灣，根據衛生福利部疾病管制署（CDC）統計，每年通報的蛇咬傷病例約 1000 例，最常見的毒蛇包括雨傘節、眼鏡蛇、龜殼花、百步蛇、赤尾青竹絲等，這些蛇類主要分布於低海拔山區、丘陵地帶及農墾區 [2]。

三指毒素 （Three-finger toxins, 3FTx） 蛋白家族廣泛存在於多種劇毒蛇類的毒液中（圖一.a），例如：神經毒素（neurotoxins） 和細胞毒素（cytotoxins）。這些毒素會與運動神經末梢的菸鹼型乙醯膽鹼受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）結合。在正常情況下，乙醯膽鹼（acetylcholine, ACh）會與 AChR 的特定結合位點（ACh binding site）結合，進而啟動神經傳遞，使肌肉收縮。然而，當蛇毒蛋白與 AChR 結合後，會阻止 ACh 的作用，導致肌肉無法正常收縮，可能進而引發呼吸困難（圖一.b）。

目前，蛇咬傷的唯一治療方式是從免疫動物血漿中提取多株抗體（抗蛇毒血清），但由於低分子量毒素（如 3FTx）免疫原性較弱，難以誘導強效的免疫反應，導致傳統抗蛇毒血清的治療效果有限。

今年榮獲諾貝爾化學獎的 David Baker 教授的研究團隊於《Nature》期刊發表，他們的研究團隊利用自行開發的 RoseTTAFold Diffusion（RFdiffusion）演算法[3]，設計出一種能與蛇毒蛋白拮抗的結合蛋白（binder）。RFdiffusion 的概念是先隨機放置多個胺基酸殘基，使其圍繞目標毒素的 β-鏈，再根據蛋白質的二級結構（如 β-折疊）及空間關係，逐步指導蛋白質結構生成，並確保每次都能精確對準毒素暴露的 β-股，增強穩定性，最終形成能有效結抗 3FTx 蛋白的 binder（圖一.c）。設計完成後，研究人員利用 ProteinMPNN 進行序列設計，並透過 AlphaFold2 和 Rosetta 過濾，篩選出最具潛力的候選蛋白進行實驗。

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以神經毒素（neurotoxins）為例

研究團隊以眼鏡蛇科（elapid）毒蛇的標準品毒素（ScNtx）為模板（圖二.a），設計針對短鏈 α-神經毒素（short-chain α-neurotoxins） 的 binder。為了篩選最有效的結合蛋白，他們採用酵母菌表層表現技術（yeast surface display, YSD），該技術的原理是將目標蛋白基因融合至酵母細胞表面的 anchor protein，並透過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol, GPI）的附加機制，將其共價固定於細胞壁。如此一來，被表現的蛋白質可透過流式細胞儀（flow cytometry）進行快速的篩選並評估其活性。透過此方法，研究人員成功篩選並合成 44 種針對 ScNtx 的設計基因，最終確認其中一種名為 SHRT 的蛋白（約100個胺基酸）能有效與 ScNtx 結合。

後續，研究人員利用粒徑篩析層析法（Size Exclusion Chromatography, SEC）來純化 SHRT 蛋白，結果顯示純化後形成單一峰體，這表明 SHRT 在溶液中主要以單一蛋白分子的形式存在，而非聚集成團（圖二.b）。隨後，研究團隊利用表面電漿共振（Surface Plasmon Resonance, SPR） 技術，這項技術可透過偵測感應器附近折射率的變化來測量蛋白質的結合、分離、親和力及熔點（Tm），而且無需對蛋白質進行標記即可即時偵測分子間的交互作用（圖二.c）。接著，研究人員利用 CD 光譜分析 SHRT 的二級結構，發現其呈現典型的 αβ 蛋白光譜特徵，顯示其摺疊結構符合預期。進一步測試顯示，SHRT 的熔點（Tm）高達 78°C，顯示它擁有極高的熱穩定性（圖二.d）。最後，研究人員透過 X 光晶體學技術解析了 SHRT 在 apo（未結合配體）狀態下的三維結構，結果顯示其構型與原先設計的電腦模型幾乎完全一致。此外，SHRT 可與神經毒素的 loop III 區域結合，此區域為神經毒素攻擊菸鹼型乙醯膽鹼受體（nAChRs）的關鍵結合位點（圖二.e）。這項結果表明 SHRT 具有拮抗潛力，能有效中和神經毒素。研究團隊使用相同的設計流程，並針對細胞毒素（cytotoxins）篩選出相對應的結合蛋白，並將其命名為 LNG。

SHRT 為針對 ScNtx 毒素設計的結合蛋白，而 LNG 則專一性結合 α-cobratoxin。研究人員將結合蛋白與對應毒素 以 1:10 或 1:5 的莫耳比混合，並注射至接受致死劑量的小鼠體內，監測 24 小時內的存活率。(1) 預防性試驗顯示，SHRT 能完全中和 ScNtx（圖三,藍色，第 3 欄），但對 α-cobratoxin 無效（圖三,藍色，第 2 欄）。相反地，LNG 可完全中和 α-cobratoxin（圖三,紫色，第 3 欄），但無法中和 ScNtx（圖三,紫色，第 2 欄）。(2) 延遲給藥試驗顯示，毒素注射 15 分鐘後給予結合蛋白，SHRT 和 LNG 仍能提供 100% 存活率（圖三,第 4 欄）。毒素注射 30 分鐘後給藥，SHRT 仍可完全中和 ScNtx，而 LNG 則對 α-cobratoxin 提供 60% 存活率（圖三,第 5 欄）。(3) 低劑量試驗顯示，SHRT 於 1:5 比例且毒素注射 15 分鐘後給予 時，仍確保 100% 存活，而 LNG 則提供 80% 保護率。所有存活小鼠於 24 小時、48 小時及 2 週內皆無神經毒性相關症狀，顯示 SHRT 與 LNG 具良好安全性與專一性（圖三）。動物實驗結果顯示，SHRT 與 LNG 均可有效保護小鼠免受致命劑量的神經毒素影響。

傳統的蛇毒血清製備方式，主要依賴動物免疫反應產生的抗體，並從動物血液中提取血清。然而，傳統製備過程存在一些缺點，例如：需要大量犧牲動物、生產週期長，且可能引發異體蛋白反應。由於血清來自異種動物，患者可能會對血清產生免疫反應，進而引發不良反應。最重要的是，傳統血清對某些蛇毒的中和效果有限，特別是對一些低分子量的神經毒素，其免疫原性較弱，難以激發有效的免疫反應，因此傳統抗蛇毒血清的治療效果往往受限。本研究所設計的新型蛋白質具有成為治療強化劑的潛力，未來的研究方向包括：

(1) 作為強化劑：將新型蛋白質與傳統抗蛇毒血清聯合使用，以提高治療效果。

(2) 開發更廣譜的抗蛇毒血清：利用 RFdiffusion 技術設計能夠中和更多種類蛇毒毒素的蛋白質，從而開發出更廣譜的抗蛇毒血清。

(3) 推進臨床試驗：基於臨床前研究取得的積極成果，盡快將新型抗蛇毒血清推向臨床試驗，以評估其在人體中的安全性和有效性。

Main Article:
Vázquez Torres, S., Benard Valle, M., Mackessy, S. P., Menzies, S. K., Casewell, N. R., Ahmadi, S., Burlet, N. J., Muratspahić, E., Sappington, I., Overath, M. D., Rivera-de-Torre, E., Ledergerber, J., Laustsen, A. H., Boddum, K., Bera, A. K., Kang, A., Brackenbrough, E., Cardoso, I. A., Crittenden, E. P., Edge, R. J., … Baker, D. (2025). De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins. Nature, 10.1038/s41586-024-08393-x. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41586-024-08393-x

參考文獻：

1. https://www.who.int/health-topics/snakebite#tab=tab_1
2. https://www.mohw.gov.tw/cp-3199-22245-1.html
3. Watson, J.L., Juergens, D., Bennett, N.R. et al. De novo design of protein structure and function with RFdiffusion. Nature 620, 1089–1100 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06415-8

撰文｜蔡伊婷
審稿｜林書岑