在免疫治療領域中，調節型 T 細胞（regulatory T cells， Treg）因其能夠抑制過度的免疫反應，被視為治療自體免疫疾病、移植排斥及慢性發炎的重要工具。雖然體內自然發育的 Treg（nTreg）具有良好穩定性，但來源有限，不易大量取得。相較之下，CD4⁺ naïve T cells 能在 TGF-β 與 IL-2 的刺激下被誘導為誘導型 Treg（iTreg），提供看似無限且可客製化的細胞來源。然而，一個長期困擾臨床應用的問題是：iTreg 經常在體外擴增或體內環境中失去 FOXP3 表現，使其治療效果無法維持。為了解決這個問題，本研究透過一系列分子生物學實驗，發現其核心的調控因子——RBPJ 蛋白。
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免疫耐受性（Immune Tolerance）指的是免疫系統不會對自身產生的抗原產生反應。而周邊免疫耐受性（Peripheral Immune Tolerance）指的是成熟的 T 細胞若在周邊組織辨識自身抗原時，會誘發 T 細胞的不反應性或是細胞凋亡，也可以經由調節型 T 細胞（Regulatory T cells, Treg）調節可能對自身抗原產生反應的 T 細胞，以避免產生自體免疫反應。另外，Treg 也可在免疫系統活化後協助免疫反應恢復平衡，以避免過度活化。
當 CD4⁺ naïve T cells 分化成 Treg 後，會同時帶有 CD4+ 和 FOXP3 轉錄因子蛋白。為了系統性研究 FOXP3 如何影響調節型 T 細胞的分化機制，研究團隊在人類 CD4⁺ naïve T cells 中進行 SLICE（sgRNA lentiviral infection with Cas9 protein electroporation）CRISPR實驗。首先，以慢病毒（lentiviral）載體導入涵蓋全基因組的單股引導 RNA（single guide RNA, sgRNA），使每個細胞僅帶有一個 sgRNA。接著透過電穿孔方式將 Cas9 蛋白遞送進入細胞內，使其與 sgRNA 形成核酸酶–RNA 複合物（RNP），並對目標基因的進行剃除（圖片一）。
圖片一、以 SLICE–CRISPR 進行人類 CD4⁺ naïve T 細胞之全基因組篩選流程。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5
完成基因編輯後，細胞會先進行擴增，後續以 TGFβ 與 IL-2 誘導其分化為誘導型調節性 T 細胞（induced Treg, iTreg）。在誘導 72 小時後，研究團隊以流式細胞儀（flow cytometry）定量細胞內 FOXP3 蛋白表現，並依 FOXP3 螢光強度將細胞分為 FOXP3low 與 FOXP3high 兩群。在此 genome-wide CRISPR screening 中，由於每個細胞僅帶有一個 sgRNA，因此每個 sgRNA 即代表剃除一個基因。藉由比較兩群細胞中 sgRNA 的相對富集量（enrichment）推斷各基因對 FOXP3 的影響。例如：若某 sgRNA 出現在 FOXP3high 群體中，表示剃除該基因會讓 FOXP3 表現上升，此基因便屬於 FOXP3 的負向調控者（negative regulator，紅色，圖片二）。反之，若某 sgRNA 出現在 FOXP3low 群體中，表示剃除該基因使 FOXP3 表現下降，此基因則屬於正向調控者（positive regulator，藍色，圖片二）。
圖片二、以 SLICE–CRISPR篩選結果之火山圖分析。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5
為了進一步驗證候選基因對 iTreg 的調控功能，研究團隊以 CRISPR 逐一剔除候選基因，並分別評估兩項關鍵指標：（1）FOXP3⁺ 細胞中的平均螢光強度，反映 FOXP3 蛋白的表現量；（2）誘導 FOXP3⁺ 細胞成功的細胞數，代表成功誘導 iTreg 的效率。結果顯示，RBPJ 基因剔除後，不僅成功誘導 FOXP3⁺ 細胞的比例顯著增加，其 FOXP3 蛋白表現量亦同步提升。相較其他候選基因，剔除 RBPJ 所帶來的效應更為明顯。此結果顯示 RBPJ 是 FOXP3 的負向調控蛋白，並會影響 iTreg 的分化（圖片三）。
圖片三、負向與正向調控因子對 iTreg 中 FOXP3 表現的影響。兩項關鍵指標：（1）FOXP3⁺ 細胞中的平均螢光強度(FOXP3 MFI of FOXP3+ cells)。（2）誘導 FOXP3⁺ 細胞成功的細胞數(FOXP3+ cells (%))
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5
RBPJ（Recombination signal Binding Protein for immunoglobulin kappa J region） 是一個在 Notch 訊號路徑中扮演核心角色的轉錄因子。它會與其他蛋白合作，決定基因是否被開啟。在一般 T 細胞中，RBPJ 會與多個分子協作，組成一個強力的轉錄抑制複合體，該複合體可直接結合於 FOXP3 基因的啟動子區域，使當地染色質維持在緊密、難以被啟動的狀態（圖片四 a）。然而，將 RBPJ 進行基因剔除（knock-out, KO）後， FOXP3 不僅可以穩定表現，與 Treg 功能相關基因（例如 CTLA-4、TIGIT）表現量也有提高（圖片四 b）。這代表 RBPJ-KO iTreg 不只是穩定，還具備更強的免疫調控能力，具備成為細胞治療的潛力。
圖片四、剔除RBPJ 以提升 iTreg 穩定性的作用機制
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41392-025-02284-x
為了評估負向調控蛋白 RBPJ 在誘導型調節 T 細胞（iTreg）分化中的臨床應用潛力，研究團隊利用基因編輯技術，將人類 CD4⁺ naïve T cells 改造成攜帶 RBPJ 缺失的誘導性調節T 細胞，並在 in vivo 異種移植（xenogeneic）小鼠模型中測試其治療效果（圖片五 a）。nTreg 是在胸腺（thymus）中完成分化的調節型 T 細胞，具有穩定的 FOXP3 表現並展現良好的治療效果。在本實驗中，nTreg 被作為效力評估的標準組（圖片五 b, 綠色曲線），實驗結果顯示，透過剔除 RBPJ 可顯著提升 iTreg 細胞的治療效能，使其在功能上趨近於 nTreg，展現出潛在的臨床應用價值。
圖片五、in vivo 異種移植（xenogeneic）小鼠模型實驗
(1） nTreg（綠色曲線）與未接受任何 Treg 細胞的小鼠（黑色曲線）相比，nTreg 明顯提升小鼠的存活率。（2）接受 iTreg 細胞（藍色曲線）的小鼠和未接受任何 Treg 細胞的小鼠（黑色曲線）相比，存活率並沒有改善。相較之下， 攜帶 RBPJ 缺失的 iTreg 細胞（橘色曲線） 的小鼠，存活率有顯著改善。(3)攜帶 RBPJ 缺失的 iTreg 治療效果（橘色曲線）與 nTreg （綠色曲線）相當。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5
整體而言，RBPJ 的缺失不僅能解除對 FOXP3 的轉錄抑制，還能調節 FOXP3 下游相關基因的表現，使誘導型調節型 T 細胞（iTreg）在分化過程中展現出更高的穩定性與功能活性，能持續表達 FOXP3 並有效執行免疫抑制功能。基於這些特性，RBPJ-KO iTreg 在未來有望被開發為治療自體免疫疾病、移植排斥、慢性發炎或其他免疫失衡相關疾病的臨床細胞治療產品，展現極大的應用潛力。
Main Article: Chen, K. Y., Kibayashi, T., Giguelay, A., Hata, M., Nakajima, S., Mikami, N., Takeshima, Y., Ichiyama, K., Omiya, R., Ludwig, L. S., Hattori, K., & Sakaguchi, S. (2025). Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3. Nature, 642(8066), 191–200. https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5
參考文獻：
1.Beumer, N., Delacher, M. Induced regulatory T cells for therapy: targeting RBPJ to enhance stability and function. Sig Transduct Target Ther 10, 193 (2025). https://doi.org/10.1038/s41392-025-02284-x
撰文｜蔡伊婷
審稿｜林書岑
