免疫系統的調節機制細密繁複，敵我識別更是一大關鍵：在防禦外來病原的同時，也須避免攻擊自身細胞。免疫細胞成熟的過程中，會經歷中樞免疫耐受（central immune tolerance），在胸腺排除可能攻擊自體的免疫細胞。
然而，免疫系統的調控不僅止於此，在周邊系統也會進一步清除未在中樞被篩選掉、仍會攻擊自身細胞的淋巴球。2025 年諾貝爾生理或醫學獎頒發給三位發現周邊免疫耐受（peripheral immune tolerance）機制的科學家 Mary Brunkow、Fred Ramsdell、與 Shimon Sakaguchi，他們的研究奠定了我們對於調節型 T 細胞（regulatory T cells, Tregs）功能的知識基礎，也確立了 Tregs 分化過程的主控基因（master gene）FOXP3。
Investigator 選文｜2025 諾貝爾生醫獎
Investigator 選文｜免疫療法
延伸閱讀｜[Nobel Prize] Scientific Background: Immune tolerance. The identification of regulatory T cells and FOXP3
延伸閱讀｜Nature Collection: Nobel Prize in Physiology or Medicine 2025
近來科學家們正嘗試利用 iCD4+ T cells（由誘導型多能幹細胞衍生的 CD4+ T 細胞）針對造血幹細胞移植引發的免疫疾病進行細胞治療。然而，這些分泌發炎性細胞激素的輔助型 T 細胞，在治療如自體免疫疾病或移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease, GvHD）等免疫系統過度活化的病症時仍面臨瓶頸。
具有免疫抑制特性的 Tregs 則可以解決這一項問題，目前已有多項運用 Tregs 的臨床試驗，初步實驗成果顯示 Tregs 能有效預防 GvHD。然而，在臨床上如何在體外（ex vivo）維持 Tregs 的免疫抑制作用、並將其數量擴展到臨床用途所需程度（註一），仍是目前棘手的問題。
來自京都大學的研究團隊數年來致力於應用 iPSC 進行 T 細胞再分化（redifferentiation）的相關研究 [1] [2] [3]，亦進一步推廣到免疫療法。研究發現這些 iPSC 衍生的 T 細胞並未耗竭（exhausted），且具有高度增生能力。此外，人工胸腺類器官（artificial thymic organoid, ATO）的立體培養系統也提供研究與生成 iPSC 衍生 T 細胞的嶄新環境（圖一）[4]。這些 CD4 T 細胞大部分為傳統輔助型 T 細胞（conventional helper T cells, Tconvs）；部分周邊初始 T 細胞（peripheral naïve T cells）可在有 TGF-β 的環境下，藉由抗原刺激轉換為 Tregs，也為 Tregs 的體外應用帶來新契機。
圖一、ATO 是在一個立體類器官環境中，以不同細胞激素與化合物組合，階段性地誘導並決定多能幹細胞的細胞命運與分化，透過造血特化（hematopoietic specification）衍生出中胚層（embryonic mesoderm）乃至分化為帶有多樣 TCR 受體庫（repertoire）且具有傳統（conventional）分化抗原（CD3+CD8αβ+ 或 CD3+CD4+）的初始 T 細胞。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.12.011
研究團隊在有 IL-2 的培養條件下，透過結合不同化合物與細胞激素，初步測試在不同的 CD4+ T 細胞群中（共三類別：CD25+CD127- Tregs、Tconvs、naïve Th0），是否能誘導 FOXP3 基因表現，進而生成近似於 Tregs 的細胞。這些化合物主要作用於 Tregs 分化與作用的生物途徑，包含：CDK8/19 抑制劑 AS2863619、mTOR1/2 抑制劑 rapamycin、TNFR2 的 致效性單株抗體 MR2-1、以及 TGF-β。
團隊接著探討這些化合物組合是否也能有效在 ATO 系統中誘導 iCD4+ T 表現 FOXP3，並發現結合上述四種化合物與細胞激素（合稱 AMRT）時，細胞表現 FOXP3 的比例最高，且這些 FOXP3+ iCD4+ T 細胞未表達 CD127，其他效應細胞激素（effector cytokines）的表現程度也因此下降（圖二）。
圖二、比較在有 IL-2 的條件下，結合不同化合物與細胞激素，測試是否能有效在 ATO 系統中誘導 iCD4+ T 表現 FOXP3。圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
由於 FOXP3 往往僅在人類 T 細胞活化時短暫表現，僅有 FOXP3 表現尚不足以佐證其具有免疫調節功能。團隊因此進一步以亞硫酸鹽 PCR 定序（bisulfite PCR sequencing）驗證細胞在 Tregs 特異去甲基化區域（Treg-specific demethylation region, TSDR） FOXP3 CNS2 的去甲基比例 [5]，以確認其免疫調節功能，並發現相較於僅給予 IL-2 的情形，經過 AMRT 處理後的iCD4+ T 細胞（86.6%）中 TSDR 去甲基化程度與初代 Tregs（primary Tregs） （93.0%）相近。
為瞭解初代 Tregs 與 iCD4+ T 細胞的基因表現的差別與異質性，團隊以單細胞 RNA 定序（single-cell RNA sequencing, scRNAseq）分析 AMRT 刺激後培養後不同天數的 iCD4+ T 細胞、與不同 Tregs 細胞源在相同培養天數下的基因表現圖譜（圖三）。研究結果顯示，在以 AMRT 擴增 14 天後，iCD4+ T 細胞與 Th0 衍生的 Tregs 的 FOXP3 表現上調，而 CD25+CD127- Tregs 在擴增 14 天後，亦有高比例的細胞 FOXP3 表現仍維持上調狀態；其他如 IL2RA 與 IKZF2 等與 Tregs 作用有關聯的基因，在三組細胞中的表現程度也有相似趨勢。整合三組細胞的 scRNAseq 數據並進行基因差異表現分析後，分為 16 個細胞群落：有一小部分的 AMRT iCD4+ T 細胞與已擴增的 CD25+ CD127- Tregs 皆分布於表現與調節功能相關基因的細胞群落（圖中黃色圓圈部分），而另一大群 AMRT iCD4+ T 細胞則與 Th0 衍生的 Tregs 同樣分布於表現效應功能相關基因的細胞群落（圖中紅色圓圈部分）。
圖三、以 scRNAseq 探討初代 Tregs 與 iCD4+ T 細胞的基因表現的差別與異質性。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
團隊後續以混合淋巴球反應試驗（mixed lymphocyte reaction assay, MLR assay）探討上述三個不同類別的 Tregs 是否可有效抑制 T 細胞擴增，並發現三者都有抑制細胞毒性 T 細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）活化的作用。
此外，有鑑於具抗原特異性 T 細胞在臨床上的應用與對於造血幹細胞移植後 GvHD 的治療前景，團隊也運用嵌合式抗原受體（chimeric antigen receptors, CARs）探討 AMRT iCD4+ T 細胞的抗原特異免疫抑制作用，評估推展應用於疾病治療的潛能，發現在 AMRT iCD4+ T 細胞中，在多株同種異型 T 細胞受體（alloreactive TCR）介導的抑制作用下，不論是否有 CAR 表現，皆可強烈抑制同種異型 CTL 增生（圖四）。
圖四、由多株 TCR 介導的同種異型抗原辨識（alloantigen recognition）較可能是引起局部的免疫抑制作用，而非基於 CAR 的抗原辨識。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
團隊也將研究探討範疇推展到異種（xenogeneic）的 GvHD 小鼠模型，發現在有 CAR 修飾的情況下，AMRT iCD4+ T 細胞降低體重減輕問題並延長小鼠壽命的程度與 CD25+ CD127- CAR-Tregs 相近，並推測這項機制可能是能有效針對表現 HLA-A2 的細胞、且在 Tregs 中透過 CD28 衍生的共刺激區（costimulatory region）促進其作用的緣故。
圖五、AMRT iCD4+ T 細胞降低體重減輕問題並延長 GvHD 小鼠壽命。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
圖六、由 ATO 系統衍生出的 iCD4+ T 細胞，透過 AMRT 誘導轉化為 Treg-like cells。植入小鼠後則可以在小鼠模型中控制異種 GvHD。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
註一：臨床上所需的 Tregs 數量，會因不同疾病與部位而異。目前臨床試驗所使用的數量層級約為 0.5~10×106 cells/kg Tregs：例如第一型糖尿病、腎臟移植、過繼性細胞治療（adoptive cell therapy）在試驗中所使用數量參考。
Main Article: Yano, H., Koga, K., Sato, T., Shinohara, T., Iriguchi, S., Matsuda, A., Nakazono, K., Shioiri, M., Miyake, Y., Kassai, Y., Kiyoi, H., & Kaneko, S. (2024). Human iPSC-derived CD4+ Treg-like cells engineered with chimeric antigen receptors control GvHD in a xenograft model. Cell stem cell, 31(6), 795–802.e6. https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.004
參考文獻：
[1] Kawai, Y., Kawana-Tachikawa, A., Kitayama, S., Ueda, T., Miki, S., Watanabe, A., & Kaneko, S. (2021). Generation of highly proliferative, rejuvenated cytotoxic T cell clones through pluripotency reprogramming for adoptive immunotherapy. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 29(10), 3027–3041. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.05.016
[2] Minagawa, A., Yoshikawa, T., Yasukawa, M., Hotta, A., Kunitomo, M., Iriguchi, S., Takiguchi, M., Kassai, Y., Imai, E., Yasui, Y., Kawai, Y., Zhang, R., Uemura, Y., Miyoshi, H., Nakanishi, M., Watanabe, A., Hayashi, A., Kawana, K., Fujii, T., Nakatsura, T., … Kaneko, S. (2018). Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell stem cell, 23(6), 850–858.e4. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.10.005
[3] Nishimura, T., Kaneko, S., Kawana-Tachikawa, A., Tajima, Y., Goto, H., Zhu, D., Nakayama-Hosoya, K., Iriguchi, S., Uemura, Y., Shimizu, T., Takayama, N., Yamada, D., Nishimura, K., Ohtaka, M., Watanabe, N., Takahashi, S., Iwamoto, A., Koseki, H., Nakanishi, M., Eto, K., … Nakauchi, H. (2013). Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell stem cell, 12(1), 114–126. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.11.002
[4] Montel-Hagen, A., Seet, C. S., Li, S., Chick, B., Zhu, Y., Chang, P., Tsai, S., Sun, V., Lopez, S., Chen, H. C., He, C., Chin, C. J., Casero, D., & Crooks, G. M. (2019). Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell stem cell, 24(3), 376–389.e8. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.12.011
[5] Lee, W., & Lee, G. R. (2018). Transcriptional regulation and development of regulatory T cells. Experimental & molecular medicine, 50(3), e456. https://doi.org/10.1038/emm.2017.313
撰文｜陳品萱
審稿｜林書岑
