幹細胞體學 —— 單維到多維的細胞塑性

2006 年 Yamanaka 團隊提出誘導性多功能幹細胞 (Induced pluripotent stem cells, iPS cells) 跨時代的發現後，打破過往從胚胎幹細胞到分化成熟細胞，分化單一方向不可逆的既定認知。當科學家意外發現上帝的重啟樞紐後，iPS 細胞一夜之間成為新寵兒，陸續被應用至各項研究。其中，iPS 細胞最具潛能的價值在於，回到幹原性的細胞能夠被追蹤其分化發育的過程，或是推演疾病模式的機轉。然而，它的效率低，以及最為人詬病的是重新編製過程中最主要的四個轉錄因子 (Oct4, Sox2, c-Myc 和 Klf4) 中，c-Myc 本身是一個安全堪慮的致癌基因。因此，若是清楚了解重新編製的過程中，分子層面上的特性與改變，將有助於後續改良和研究的推演。承續轉錄、表觀遺傳、蛋白等體學的蓬勃進展，此領域幹細胞體學也因應而生（註一）。

過去研究顯示，重新編製是一個多階段的過程，把握每一個關鍵轉錄因子適時適量地參與。為了更準確地了解編製的每一個階段，2009 年 Woltjen 團隊利用 doxycycline 去誘導 piggyBac (PB) 轉位子攜帶關鍵轉錄因子的活化，建立了間接誘導性多功能幹細胞 (secondary iPS cells, 2º iPSC)。同時搭配次世代定序檢驗全面基因組 CpG 甲基化程度、轉錄體短長鍊 RNA 的表現、染色質表觀遺傳表徵，以及蛋白質體的數據，架構出細胞重新編製的藍圖。

當纖維母細胞在 doxycycline 誘導下重新編製的第 2 天，細胞黏附分子和外胚層分化相關的基因會被活化，第 5 天到 8 天則是細胞黏附分子和免疫相關的基因活化，重新編製前期的基因活化表徵與間質–上皮轉換 (mesenchymal–epithelial transition, MET) 過程相似。在第 8 天後開始降低 doxycycline 的濃度，將可以在第21天得到基因表徵與 iPSC 相同的 2º iPSC （稱 ESC-like 細胞）。然而，若是持續維持高濃度的 doxycycline 則會得到另一群 F-class 細胞 （雖然高表現多功能幹細胞相關基因 Nanog 和 Sall4，但同時表現神經發育等分化相關基因）。這些證據顯示，轉錄因子的活化在重新編製過程中，必須是階段性精準調控，全程參與並非絕對必要。研究中也觀察到，前期染色質會大量地失去 H3K27me3 （抑制分化相關基因的染色質修飾表徵） ，並在第 8 天達到低峰。後期則不管是在 F-class 或是 ESC-like 細胞的兩種途徑中， H3K27me3 則會逐漸回復增加。這個結果和前期 Kdm6a 去甲基酶大量活化、 PRC2 甲基酶複合體表現量低，造成異染色質 (heterochromatin) 的減少得以相互映證。

然而在重新編製過程中，細胞的異質性比科學家想像中複雜許多。透過 H3K4me3 、 H3K27me3 和 H3K36me3 三個修飾表徵，可以將細胞分成多個亞群。但結果發現，當重新編製因子高度表現時，細胞將會減低其異質性，H3K4me3+ H3K27me3+ 細胞在編製前期會因為失去 H3K27me3 成為 H3K4me3+ H3K27me3- 細胞，此時大量的細胞黏附分子、重新編製相關的基因會被活化。然而，到了後期，該細胞群會因為重獲 H3K27me3 程度的差異而分成兩群。F-class細胞因為高濃度的轉錄因子表現，回復且維持高程度的 H3K27me3 ，持續抑制 ESC-like 相關的基因，同時有 66% 的重新編制基因會受到 H3K4me3 的增加而調控，且在 ESC-like 階段，這些基因的 DNA 甲基化程度會大幅減少。

另外，長鏈非編碼 RNA (lncRNAs) 被認為會和染色質調控蛋白作用，輔助維持胚胎幹細胞分化基因不被活化。在此系統中也發現，LncRNAs 的活化與早期 H3K27me3 的失去、晚期 H3K4me3 的增加及 DNA 甲基化的維持相關。

為了比較 F-class 、 ESC-like 階段細胞的差異，作者利用轉錄體和蛋白體的研究，發現細胞在 F-class 階段時分裂與代謝相關機轉明顯高於 ESC-like 階段，相反地， ESC-like 階段卻有著高度表現的多功能和早期發育相關基因。另外第 5 天到 11 天，有一群被認為和重新編製早期活化相關的基因群，會在 F-class 中大幅被抑制，在 ESC-like 階段卻持續被活化。對應先前曾提及的，早期 H3K27me3 的失去會誘導該群基因的活化，到之後 F-class 階段又因恢復 H3K27me3 導致染色質結構的抑制，讓該群基因群不再被活化。相反地， ESC-like 階段的細胞因 H3K4me3 增加，讓更多的 DNA 去甲基化，持續活化該群基因。

總結來說，作者成功利用 doxycycline 的誘導，搭配體學研究，建立細胞重新編製的藍圖。要回復細胞幹原性，大致分為兩個關鍵階段：第一步必須克服先天 DNA 甲基化的屏障，促使細胞往 ESC-like 階段走，第二步是 H3K27me3 能精準地在晚期降低其對重新編製基因的負向調控，避免細胞走向 F-class 階段。本文揭示科學家如何去推究複雜系統裏潛藏的規則，透過重新編製藍圖的建立，以及關鍵因子角色與時間序的確立，將可以更準確地探討分化發育或是釐清致病機轉。

 

參考資料：

1. Hussein, Samer M. I., Puri, Mira C., Tonge, Peter D., Benevento, Marco, Corso, Andrew J., Clancy, Jennifer L., . . . Nagy, Andras. (2014). Genome-wide characterization of the routes to pluripotency. Nature, 516, 198. doi:10.1038/nature14046

 

 

註一：Australian Institute of Bioengineering and Nanotechnology (AIBN). (n.d.). Stemformatics – Find expression data from leading stem cell laboratories in a format that is easy to search, easy to visualise and easy to export. Retrieved from https://www.stemformatics.org/