基因在特定細胞、特定時間下適切地表達對於生物的生長發育極具重要性，有許多特定 DNA 序列和活化子、轉錄因子等參與其中。傳統的生化、分子生物分析已為相關機制提供了許多重要的解答，但鮮少有研究以分子動力學的角度切入，觀察並定量地描述轉錄因子如何在細胞內動態地尋找其對應的 DNA 序列。而就在去年，來自 Howard Hughes Medical Institute（HHMI） 的研究員 Zhe Liu 與其所率領的研究團隊以胚胎幹細胞中的 Sox2 和 Oct4 為題材，藉由分析單分子影像建構其動力學模型，為這個議題做出了卓越的貢獻。研究團隊發現：（1）Sox2 和 Oct4 乃是經由一系列反覆試誤的過程才會結合到其專一的 DNA 序列上，而該試誤過程包含了轉錄因子在立體空間中反覆嘗試與不同 DNA 序列結合，以及沿著結合之處的 DNA 滑動；（2）Sox2 與 Oct4 所形成的增強體（enhanceosome）必須以一定順序結合到 DNA 上。
建構該動力學模型需要測量若干參數：轉錄因子與 DNA 的解離常數、結合常數、碰撞次數……等。首先，為了獲得解離常數，研究團隊分析了帶有螢光的 Sox2 在 2D 影像下於細胞內的運動軌跡。藉由擬合螢光點數目隨時間消失的曲線（註一），將可以得到 Sox2 與 DNA 的解離常數。令人驚訝的是，Sox2 與 DNA 的解離曲線並無法由單一的指數函數所描述，而是必須由兩個解離常數相差約十倍以上的指數函數疊合而成，暗示了 Sox2 與 DNA 存在兩種不同的結合方式：解離常數小者在 DNA 上停留時間（τs）較久，推測應是與較專一的序列結合；解離常數大者則停留時間（τns）短暫，可能是 Sox2 與 DNA 的非專一性結合。而無論是專一或非專一的結合事件中，研究團隊指出 DNA 與 Sox2 的互動並非是靜態的。在離體實驗中研究團隊發現當所給予的 DNA 片段越長，Sox2 與 DNA 結合的時間就會越久，暗示了 Sox2 會沿著 DNA 前後滑動尋找目標序列。在隨機碰撞的模型中，該機制這對於提高轉錄因子和目標序列的結合的效率無疑將有很大的幫助。
接著，關於 Sox2 和 DNA 結合過程的相關參數又要如何獲得呢？由於轉錄因子在細胞核中的擴散、碰撞皆係在一 3D 空間中的運動，研究團隊利用了可建構 3D 影像的同步多焦顯微鏡（simultaneous multifocus microscopy）追蹤帶有螢光的 Sox2 個別分子的運動軌跡，引入了擴散方程和位移機率函數描述這些運動軌跡，以此獲得 Sox2 的擴散常數以及其每次與 DNA 的結合（專一或非專一）平均所需要的時間（τ3D）。
得到以上解離常數和結合常數以後，我們將能進一步推知 Sox2 專一結合至特定 DNA 位點所需的碰撞次數（約需 84 次）以及每次 Sox2 結合至其專一性 DNA 序列上所需花費的時間（約 377 秒）。利用以上參數，研究團對建構了一套反覆試誤的擴散、碰撞、滑動與解離的動力學模型。
由於在多能性幹細胞中，Sox2 與 Oct4 時常以 enhanceosome 的形式作用，因此研究團隊也想了解 Oct4 的動力學模型。過去對於 Sox2 和 Oct4 究竟是隨機組合還是具有一定組成次序並無定論。利用上述多焦顯微鏡研究發現：當細胞缺乏 Sox2 時，Oct4 穩定結合至 DNA上的比例將會顯著下降，而搜尋目標序列所需的時間和碰撞次數將會大幅增加；相反地，當在胚胎幹細胞中剔除 Oct4，Sox2 的許多動力學參數並無顯著變化。這說明了 Sox2 在 enhanceosome 的形成扮演領導因子（leading factor）的角色。
本篇所介紹的動力學模型以及實驗方法，將能夠幫助我們細緻了解和預測各種轉錄因子以及表觀遺傳學相關的調控機制是透過哪個步驟（例如：擴散速度、結合時間）來影響基因轉錄。而在生物發育過程中，各種轉錄因子隨著時間快速的變化，本研究提供的模型也提供我們一個精密的方法來推測細胞核中特定轉錄因子的濃度或者與啟動子等有效結合的比例。最後同時也十分重要的，本篇 3D 的單分子觀察技術更在未來其他表觀遺傳學研究的應用想必十分精彩，令人期待！
※ 註一：快速擴散的 Sox2 螢光訊號與背景值相當，相反地有些 Sox2 則會停留在特定位置一段時間（因與 DNA 結合）因而使曝光較為充分而也就能偵測到螢光。
建立 Sox2 和 Oct4 與 DNA 結合的分子動力學模型。圖片來源：https://tinyurl.com/yc5e3mxb
參考資料：
- Chen, J., Zhang, Z., Li, L., Chen, B., Revyakin, A., Hajj, B., … Liu, Z. (2014). Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell, 156(6), 1274-1285. doi:10.1016/j.cell.2014.01.062
- Seeing Single Molecules Move | HHMI BioInteractive. (n.d.). Retrieved from https://www.hhmi.org/biointeractive/seeing-single-molecules-move
撰稿 | 邱亮源
修訂 | 林映希
