如何輕鬆且準確地編輯遺傳密碼是生物學家長久以來的夢想。目前生物學界所廣泛使用的 Cre-LoxP 或者 Flp-FRT 系統被許多人認為步驟繁複、曠日費時且時常失敗，不足以應付日新月異的科學進展。自二十一世紀初，科學家相繼開發出 zinc finger nucleases（ZFNs）和 transcription activator-like effector nucleases（TALENs），這兩類核酸酶都是由對 DNA 序列無特異性的 Fok I 核酸酶與可辨認特殊序列的 DNA bonding domain 所構成。由於 Fok I 無法單獨作用，所以 ZFNs 和 TALENs 的設計皆必須以成對的方式從目標 DNA 的上下游夾擠所欲切割的片段，因而也就大大提高了基因工程的準確率。
然而，ZFNs 和 TALENs 都有一些致命的缺點。ZFNs 的 DNA binding domain 設計過於複雜，TALENs 則是含有高度重複的序列使得它難以使用病毒作為載體傳播。「懶惰」的科學家於是繼續找尋其他新工具。終於在 2013 年由麻省理工學院的神經生物學家張鋒（Feng Zhang）等人開發出 CRISPR/Cas9 的系統。這個系統利用嚮導 RNA （guide RNA，簡稱 gRNA）導引 Cas9 核酸酶至目標 DNA 上作用。相較於 ZFNs 和 TALENs，設計新的 RNA 來對不同的 DNA 片段進行編輯顯得簡單許多，使得這個系統一推出便熱議不斷。
不過 CRISPR/Cas9 系統一樣有個令人頭痛的問題：off-target effect。也就是 gRNA 可能會結合至非目標 DNA 上，造成非預期性的剪切。為了解決這個問題，來自麻州總醫院（Massachusetts General Hospital）的研究團隊從 ZFNs 和 TALENs 的方法中獲得靈感，將 Cas9 的核酸酶活性破壞並在 N 端接上 Fok I 形成 Fok I-dCas9，如此則將需要兩個 gRNA 同時分別接到目標 DNA 上下游的序列使剪切效果得以發生，大大降低 off-target 產生的發生機率。研究團隊把這個系統命名為 RNA-guided Fok I nucleases（RFNs）。
但是 RFNs 系統有個問題：因為大部分 gRNA 所使用的載體上的 promoter為 U6 promoter 或 T7 promoter，這使得 gRNA 的 5’ 端必然是 C 或 CC，換言之，目標 DNA 的序列也必須是 G 或 GG，研究團隊希望能夠將 gRNA 5’ 端序列擴展成可辨認 G 以外的核苷酸，於是便將 Csy4 這個 endoribonuclease 引入系統。Csy4 能夠辨認 RNA 3’ 端的 5-base-pair stem-loop，但對序列本身則無特異性，因此只要在 gRNA 的5’ 端前加上 stem loop（即圖中的 Csy site），則經 Csy4 裁切後，gRNA 的 5’ 端將可以辨認任一種核苷酸而不宥於 G 或 GG。
更多 RFNs 的詳細設計資訊可以參考研究團隊所開發的網站：http://zifit.partners.org/ZiFiT/
所設計的 RFNs 可能的 off-target 分析則可自這個網站下載相關軟體：https://bitbucket.org/vishalthapar/casper-scan
資料來源：
Tsai, S. Q., Wyvekens, N., Khayter, C., Foden, J. A., Thapar, V., Reyon, D., … Joung, J. K. (2014). Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology, 32(6), 569-576. doi:10.1038/nbt.2908
