十年磨一劍：晶格層光顯微技術

光學影像對於探索生命提供了許多重要的訊息。2014 年諾貝爾化學獎頒發給三位研發超高解析光學顯微技術（Super-resolution microscopy）的科學家，技術包括 STED（STimulated Emission Depletion microscopy）與 PALM（PhotoActivated Localisation Microscopy）等方法，透過控制螢光分子的激發位置與時間，得以突破過去認定的光學顯微鏡之解析度限制（1/2 的光波長，約為 0.2 微米），並以奈米等級的解析度觀察到細胞內、胞器內的生物分子，成為單分子生物學、細胞與發育生物學研究的重要利器。然而，要了解活體細胞內的複雜環境與動態，甚至紀錄胚胎發育過程中細胞遷移與分子表達的歷程，則增加了光學顯微在時間與空間解析度上的挑戰，此外，顯像解析度與對觀測活體造成的光毒性（phototoxicity）更是必須相互權衡的因子。PALM 的發明者 Eric Betzig 與目前於中研院應用科學所的陳壁彰博士等人設法以「晶格層光顯微技術」（Lattice light-sheet microscopy）克服活體實況顯微攝影的困難。

二維的層光顯影同時激發一平面的螢光訊號，是過去研究觀察 3D、4D（包括隨時間的動態）影像的重要技術，但使用的高斯光束（Gaussian beam）形成的光層聚焦平面具有一定厚度而降低空間解析度，光層較薄的貝索光束（Bessel beam）則容易造成光漂白或者光毒性。本篇研究使用空間相位差調整器（Spatial Light Modulator）快速切換貝索光束而形成平面中的點陣，並搭配檢流計震盪產生連續而平整的二維掃描面，以此點陣層光掃瞄樣品，能獲得高解析、高訊噪比之 4D 影像，比過去的貝索光束掃描式顯微鏡快速，且減少光漂白。

應用此顯影技術，能在活體細胞內追蹤單分子動態，作者觀察以螢光標示的 Sox2 轉錄因子並計算平均位移，甚至能比較 Sox2 位在胞內與胞外之擴散係數差異。此外，震顫的點陣層光搭配 PALM 顯影技術，能提高解析度至 71 奈米，觀察細胞核膜的細節、內部結構與厚度。

活體細胞中，以螢光標示微管與相關連結蛋白，能計算這些分子的位置與移動速度，透過速度場的組成分析，甚至能夠區別細胞分裂時的不同時期，此外，標示組織蛋白（Histone）、粒線體與內質網，可以觀察細胞分裂時胞器與染色體的空間安排與分裂動態。另一方面，作者也以顯微技術觀察原生生物的鞭毛振動與細微運動，能在數分鐘觀察後不對活體產生顯著光毒性。接著，在細胞間質中爬行的嗜中性球、追逐目標細胞的 T 細胞動態也被精緻地紀錄，點陣層光顯影顯示肌動蛋白（actin）在細胞間形成接觸之突觸時的聚集、細胞伸出板狀偽足（lamellipodium）的過程，更可能提供細胞爬行過程中的力學訊息。

最後，胚胎發育研究中，作者設法記錄線蟲（C. elegans）與果蠅（D. melanogaster）兩種模式生物的發育過程，以螢光標定染色體、細胞膜、微管、鈣粘蛋白（cadherin）與肌球蛋白（myosin）等結構，能在胚胎中連續紀錄發育過程中的細胞分裂、分化與分子表達、運動。以果蠅為例，甚至能觀察到背側細胞構型與肌動蛋白纖維分佈的改變，顯示與之後發育歷程相關的特化結構。

「光學晶格」概念早於 2005 年時即由 Eric Betzig 提出，但直到 2014 年「晶格層光顯微術」才得以實際應用在活體生物觀察（ref. b）。本篇研究為發育生物學研究建立優良的觀察工具，在未來，亦有機會同步於細胞、個體中觀察蛋白質交互作用、運動方式。此外，經合成生物學、基因工程修飾之細胞與個體也能在此顯微技術下偵測合成蛋白、突變蛋白在生理環境下的運作。

參考資料：

Chen, B.-C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., … Betzig, E. (2014). Lattice Light Sheet Microscopy: Imaging Molecules to Embryos at High Spatiotemporal Resolution. Science (New York, N.Y.), 346(6208), 1257998. doi: 10.1126/science.1257998
觀察鮮活生物細胞的重大革新：「晶格層光顯微術」https://goo.gl/BXHsn1
影音連結：面對關鍵人物 / 陳壁彰
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