生物物理 研究領域專題 細胞與發育生物學

十年磨一劍:晶格層光顯微技術

光學影像對於探索生命提供了許多重要的訊息。2014 年諾貝爾化學獎頒發給三位研發超高解析光學顯微技術(Super-resolution microscopy)的科學家,技術包括 STED(STimulated Emission Depletion microscopy) 與 PALM(PhotoActivated Localisation Microscopy)等方法,透過控制螢光分子的激發位置與時間,得以突破過去認定的光學顯微鏡之解析度限制(1/2 的光波長,約為 0.2 微米),並以奈米等級的解析度觀察到細胞內、胞器內的生物分子,成為單分子生物學、細胞與發育生物學研究的重要利器。然而,要了解活體細胞內的複雜環境與動態,甚至紀錄胚胎發育過程中細胞遷移與分子表達的歷程,則增加了光學顯微在時間與空間解析度上的挑戰,此外,顯像解析度與對觀測活體造成的光毒性(phototoxicity)更是必須相互權衡的因子。PALM 的發明者 Eric Betzig 與目前於中研院應用科學所的陳壁彰博士等人設法以「晶格層光顯微技術」(Lattice light-sheet microscopy)克服活體實況顯微攝影的困難。

二維的層光顯影同時激發一平面的螢光訊號,是過去研究觀察 3D、4D(包括隨時間的動態)影像的重要技術,但使用的高斯光束(Gaussian beam)形成的光層聚焦平面具有一定厚度而降低空間解析度,光層較薄的貝索光束(Bessel beam)則容易造成光漂白或者光毒性。本篇研究使用空間相位差調整器(Spatial Light Modulator)快速切換貝索光束而形成平面中的點陣,並搭配檢流計震盪產生連續而平整的二維掃描面,以此點陣層光掃瞄樣品,能獲得高解析、高訊噪比之 4D 影像,比過去的貝索光束掃描式顯微鏡快速,且減少光漂白。

應用此顯影技術,能在活體細胞內追蹤單分子動態,作者觀察以螢光標示的 Sox2 轉錄因子並計算平均位移,甚至能比較 Sox2 位在胞內與胞外之擴散係數差異。此外,震顫的點陣層光搭配 PALM 顯影技術,能提高解析度至 71 奈米,觀察細胞核膜的細節、內部結構與厚度。

活體細胞中,以螢光標示微管與相關連結蛋白,能計算這些分子的位置與移動速度,透過速度場的組成分析,甚至能夠區別細胞分裂時的不同時期,此外,標示組織蛋白(Histone)、粒線體與內質網,可以觀察細胞分裂時胞器與染色體的空間安排與分裂動態。另一方面,作者也以顯微技術觀察原生生物的鞭毛振動與細微運動,能在數分鐘觀察後不對活體產生顯著光毒性。接著,在細胞間質中爬行的嗜中性球、追逐目標細胞的 T 細胞動態也被精緻地紀錄,點陣層光顯影顯示肌動蛋白(actin)在細胞間形成接觸之突觸時的聚集、細胞伸出板狀偽足(lamellipodium)的過程,更可能提供細胞爬行過程中的力學訊息。

最後,胚胎發育研究中,作者設法記錄線蟲(C. elegans)與果蠅(D. melanogaster)兩種模式生物的發育過程,以螢光標定染色體、細胞膜、微管、鈣粘蛋白(cadherin)與肌球蛋白(myosin)等結構,能在胚胎中連續紀錄發育過程中的細胞分裂、分化與分子表達、運動。以果蠅為例,甚至能觀察到背側細胞構型與肌動蛋白纖維分佈的改變,顯示與之後發育歷程相關的特化結構。

「光學晶格」概念早於 2005 年時即由 Eric Betzig 提出,但直到 2014 年「晶格層光顯微術」才得以實際應用在活體生物觀察(ref. b)。本篇研究為發育生物學研究建立優良的觀察工具,在未來,亦有機會同步於細胞、個體中觀察蛋白質交互作用、運動方式。此外,經合成生物學、基因工程修飾之細胞與個體也能在此顯微技術下偵測合成蛋白、突變蛋白在生理環境下的運作。

參考資料:

  1. Chen, B.-C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., … Betzig, E. (2014). Lattice Light Sheet Microscopy: Imaging Molecules to Embryos at High Spatiotemporal Resolution. Science (New York, N.Y.)346(6208), 1257998. doi: 10.1126/science.1257998
  2. 觀察鮮活生物細胞的重大革新:「晶格層光顯微術」https://goo.gl/BXHsn1
  3. 影音連結:面對關鍵人物 / 陳壁彰
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    PART 4 https://goo.gl/AuYgkx
撰稿人|陳曦
「晶格層光顯微術」可以用不到1秒時間取得一個活體影像,而且可以研究整個細胞分裂的過程。圖片來源:doi: 10.1126/science.1257998

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