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突破原子級解析度:冷凍電顯異軍突起

自從發明顯微鏡,人類得以一窺肉眼無法看到的世界後,持續追求更高解析度、觀測比細胞更小的奈米尺度結構成了科學家的目標。在二十世紀前半,電子顯微鏡的發明更是將解析度推進到光學顯微鏡無法看到的病毒與次細胞結構大小。就算如此,科學家還是不滿意,因為電子顯微鏡的解析度仍無法讓我們看清生物內的巨分子,例如影響蛋白質功能的細部結構。

想要解析蛋白質在原子等級的結構,目前的方法主要有 X 光晶體繞射(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance)。兩者皆有其限制:X 光繞射要求樣品必須要先結晶,若結晶困難怕是無法解讀;核磁共振則只能看到小於 40-50 KDa 的物質,同時兩者皆要求樣品必須純化出毫克以上(見結構生物學專題)。

於是,冷凍式電子顯微鏡(cryo-electron microscopy)粉墨登場,相較之下不需要麻煩的結晶過程,純化的量也僅需 0.1 毫克左右。然而,電子顯微鏡的樣品必須放在真空環境,電子束才不會被空氣分子偏折,樣品通常都必須加以乾燥或用重金屬加以負染色(negative staining),因此常常無法真實反應分子在生物條件下的真實樣貌。韓德森(Richard Henderson)、杜波克特(Jacques Dubochet)等人的研究發現,我們可以用液態氮快速冷凍樣品,此時樣品中的水分子來不及形成結晶,就這樣凍在原處形成玻璃質,便能以電子顯微鏡觀察生物分子原本的樣貌。這樣的技術被稱為冷凍式電子顯微鏡,簡稱冷凍電顯(或冷凍電鏡,cryo-EM)。1968 年,德羅西爾(David DeRosier)、克盧格(Aaron Klug)透過穿透式顯微鏡將同一分子不同方向的 2D 影像投影重組成 3D 分子。將此重組技術加諸冷凍電顯之上,能推算巨分子在生理狀況下的細部構造。

儘管看似前景光明,在 1990 年代的冷凍電顯技術仍然只能達到 40 Å 之譜,到了 2000 年左右,此極限已經推進到 10 Å 左右,而 2010 年時,也只推進到了 7-9 Å,仍無法和 X 光繞射匹敵。基本上在此解析度下,只可見蛋白質大致形狀,細部構造(如 beta 褶板)仍相當模糊。直到 2013 年後,兩項重大的技術革新,彷彿達陣般,將解析度推進至 5 Å 以內,而目前最細部的解析度已達 2.5 Å。[1]

第一個突破,是電子偵測器的優化,以新型的直接電子偵測器(direct electron detector)取代原來的 CCD ,使得信噪比大幅提升。第二個突破,是電腦和演算法的進步,讓我們藉由數十萬到百萬個單一分子的 2D 投影分析還原出 3D 結構,同時採用「錄影模式」取代原本的「照相模式」,以校正電子對樣品的破壞所造成的模糊畫面。[2]

於是,冷凍電顯發展了幾十年的能量,就在這幾年內爆炸性地開花結果、造就結構生物學研究與生物物理技術上的重大突破。而當初的先驅者韓德森、法蘭克(Joachim Frank)、杜波克特等人更是獲得了 2017 年的諾貝爾化學獎。

圖說:glutamate dehydrogenase 在冷凍電顯的解析度變化,從 2013年以前(左)到 2013 年以後(右)解析度已達原子等級。圖片來源:https://goo.gl/tvUwsv

 

參考資料:

  1. Frank, J. (2017). Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols12(2), 209-212. doi:10.1038/nprot.2017.004
  2. Bai, X., McMullan, G., & Scheres, S. H. (2015). How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences40(1), 49-57. doi:10.1016/j.tibs.2014.10.005
  3. 林宇軒、曹一允、蔡蘊明(合譯)(2017)。2017年諾貝爾獎簡介。取自 https://goo.gl/7CqSCS

撰文│紀威佑

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紀威佑

紀威佑

臺大醫學系畢業,曾為臺大iGEM代表隊成員,曾於台大、中研院、AMC實驗室進行實習。對科普推廣與寫作有很大的興趣,希望能和志同道合的朋友交流,並做為知識的傳播者為科學社群盡一份心力。