改造病人 T 細胞做為新一代抗癌武器

農業生產早已受惠於發達的基因改造技術，基因改造於人體則相當罕見。現在，全球諸多團隊打算利用 CRISPR ( clustered regularly interspaced short palindromic repeat ) 等基改技術來治療癌症。藉由基改技術，科學家賦予患者的T細胞額外的辨認能力後，再注入患者體內，進而讓免疫系統主動殺死癌細胞。此療法稱為 CAR-T ( chimeric antigen receptor T cells, CAR-T )。

嵌合抗原受體 T 細胞療法 ( chimeric antigen receptor T cells, CAR-T ) 是利用基因工程改造之 T 細胞來攻擊癌細胞的一種免疫療法。首先必須收集病患個體血液中的 T 細胞，接著利用基因工程技術使 T 細胞表現能辨識癌細胞的嵌合抗原受體，此種人工的 T 細胞受體主要具備三個部分，1. 用來辨識癌細胞抗原的 Single-chain variable fragments ( scFvs ) 2. 連接細胞內外部位的交鏈區 ( spacer ) 和穿膜區 ( transmembrane domain ) 3. 位於 T 細胞內負責刺激訊號途徑的區域 ( CD3ζ和其他協同刺激分子，不同世代的 CAR-T 差別在此）。最後被放大到足夠數量的 CAR-T 可被輸注回病患體內進行癌細胞辨識和毒殺。於2009年，CAR-T 臨床試驗即針對 CD19+ 血癌進行治療，抗癌效力令人印象深刻且極具治療潛力，能讓病情完全緩解。因此，亦有不少新創公司和大藥廠積極投入 CAR-T 的研發與產品化。當然科學家們也將此一療法用於對付實體腫瘤 ( solid tumor )，然而，許多研究的治療結果不盡理想並且可能產生標靶或標靶外的毒性。去年七月 Juno Therapeutics 的 Phase II 試驗便傳出三例死亡，其原因可能與副作用相關，Juno 的股價當日重貶超過三成，FDA 還一度勒令暫停試驗。

本篇由中國第三軍醫大學為首的研究，即針對表現有癌胚抗原 ( carcinoembryonic antigen, CEA）並且已發生轉移的大腸癌病患進行 CAR-T 臨床一期研究。癌胚抗原是與細胞黏附相關的醣蛋白，其表現和製造主要是在胎兒時期的腸胃道組織。因此，健康成人血液中的 CEA 濃度非常低，胃腸道內皮細胞頂端表面少量表現並且朝向胃腸道，所以不易被免疫辨識。然而，在某些癌症中 CEA 的指數會提升，其中包括大腸癌，CEA 因而可以作為有效的 CAR-T 標靶用以治療轉移性大腸癌。

在臨床一期研究中，團隊共收了十位復發難以治癒同時具有轉移的大腸癌病人。臨床流程如下：1.血液檢測和收案 2.兩週前進行 CAR-T 細胞準備 3.一週前消除病患體內淋巴和 T 細胞 ( ymphodepletion ) 以增強或保護 CAR-T 作用 4. 第零週進行血液檢測確保病人能夠進行 CAR-T 輸注 5. 第一週的一到三天以遞增的劑量施打 CAR-T ( 10%, 30%, 60% ) 6. 第四週以放射影像進行療效評估。

施以 CAR-T 細胞之前，團隊利用流式細胞儀進行了細胞的定性。團隊定量了產物的 T 細胞、自然殺手細胞和自然殺手 T 細胞的百分比 ( 中位數分別為 94.6%, 3.4%, 15.1%, 33.7% )。 另外，也有觀察一些免疫檢查點的表現比例。在細胞毒性測試中也證實了 CAR-T 細胞會攻擊表現 CEA 的癌細胞。在副作用方面，輸注 CAR-T 細胞幾小時後，觀查到部分個體會有發燒的狀況，但都能以非固醇類抗發炎藥控制。一些個體症狀如血小板數目下降、圓禿和胃炎被歸因於淋巴球消除。其他的症狀也都與施打 CAR-T 沒有直接關係。在肝轉移較嚴重的個體中，能觀察到一些肝功能指標漸漸變壞的情況， 但這並非療法的副作用。除此之外，他們也檢查了病患的腎功能、凝血、心血管系統和呼吸系統並發現沒有任何異常。針對與 CAR-T 細胞活性相關的細胞激素釋放症候群 ( cytokine release syndrome, CRS )，團隊觀察了指標性的 C-reactive protein ( CRP )  和 IL-6 並發現多數病人在第一週不論高劑量或低劑量治療都會產生一定程度的峰值。這和其他研究的狀況雷同，實體腫瘤不易有嚴重的 CRS。

在療效評估的部分，確實觀察到多數病人施以 CAR-T 後，CEA 濃度顯著降低（圖 A）。正子影像觀察結果顯示病患九在施以第二劑（Dose-level 5）四週後相較於之前有較低的 standard uptake value（圖 B）。另外，病患十的MRI 影像則顯示施以第一劑（Dose-level 4）四周後，其中一個腫瘤病變有縮小的現象（圖 C）。為了追蹤在周邊血液和腫瘤區的 CAR-T 表現，團隊利用流式細胞儀 Protein L、帶有 His tag 的 CEA 蛋白、qPCR 和免疫組織染色的方式，得知注入 CAR-T 之後的作用時間。前兩者都無法偵測到血液中的 CAR-T ，。而 qPCR 在四至六周後，會降到觀測不到 CAR-T 基因的層度。在免疫組織染色中，順利觀察到輸注四周後確實有 CD3+ T 細胞移動到腫瘤區域，組織的 qPCR 也觀察到一定程度的 CAR-T 基因量。為了瞭解免疫環境的變化，團隊偵測周邊血液的單核球型態，發現具有免疫抑制特性的細胞如 Myeloid-derived suppressor cell 和 Treg 以及 PD-1 的表現在治療前兩週有上升。同時，多數 naïve T cell 傾向分化成 memory T cell。

總結臨床試驗結果，在癌症持續發展的 10 位病人中有 7 位得到病情的控制，並有兩位觀察到轉移腫瘤縮小。 另外，相較於其他標靶 CEA 的 T cell Receptor 之細胞（TCR-T）療法，本篇的 CAR-T 並不會引發結腸炎，推測結腸炎的發生可能跟 TCR-T 與 MHC-1呈現 CEA peptide 作用有關。對於應用 CAR-T 療法在實體腫瘤，此臨床試驗展示了 CAR-T 毒性低和副作用少的優點，並且有阻止病況惡化的能力。未來，團隊期許能增強 CAR-T 的趨化性，提升 CAR-T 浸潤實體腫瘤的能力，達到更佳的療效。

參考資料：
1.Chimeric antigen receptor ( CAR ) T -cell therapy
(https://www.lls.org/treatment/types-of-treatment/immunotherapy/chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-therapy)
2.科技產業資訊室:滅癌細胞治療法 ( CAR-T細胞療法 ) 發展進展
(http://iknow.stpi.narl.org.tw/post/Read.aspx?PostID=10533
3.Wiki Chimeric antigen receptor(https://en.wikipedia.org/wiki/Chimeric_antigen_receptor)
4.CAR is designed to reprogram the cells( https://www.junotherapeutics.com/our-science/car-technology)
5.Wiki Carcinoembryonic antigen ( https://en.wikipedia.org/wiki/Carcinoembryonic_antigen)

撰文│張智鈞
修訂│陳毓茹