DNA 序列上的表觀遺傳調控（epigenetic regulation）與轉錄後產生蛋白質的異質性（heterogeneity），有著密不可分的關係。透過這樣的機制，能再不改變基因序列的前提下，隨著不同的環境調控細胞或物種外在型態的表現。隨著基因定序技術的進步，細胞與基因之間的關係也日漸清晰，但過去的定序通常以組織或是細胞群當作樣品，在量測的過程中往往會平均掉單一細胞間的資訊，而忽略細胞異質性下隱藏的重要資訊。
單細胞定序法（single cell sequencing），對單一細胞的基因序列放大後做分析，可以有效的解決這個問題，可用於更進一步探討個別細胞和其基因序列的關係，其重要性甚至獲選為 2013 年 Nature Method 的年度技術 ；在單細胞定序法出現以後，定序技術的發展並沒有因此而趨緩，為了找出更迅速、有效、便宜分析細胞基因組的方法，各式定序法的改良版應運而生。本次所介紹的文章，以基因轉錄組定序法（genome and transcriptome sequencing, G&T）做定序，此方法奠基於以往的單細胞定序法，結合平行定序的概念，可同時分析單一細胞內基因組（genome）和轉錄組（transcriptome，意指細胞內所有能轉錄出 RNA 的集合），抽絲剝繭出細胞表觀遺傳變化與轉錄異質性間的交互關係。
圖一、基因轉錄組定序法的步驟。溶解單一細胞後 DNA 與mRNA被萃取並分離，分別經放大步驟後製做資料庫及定序（圖片來源：https://www.nature.com/articles/nmeth.3370/figures/1)
基因轉錄組定序法是後基因體時代發展的一項新技術：以單細胞定序技術為基石，利用訊息 RNA（mRNA）尾端聚腺苷酸尾（poly-A tail）的特性，將之與基因體 DNA 分離並分別進行放大與定序的方法（圖一）。而獲得基因體序列與轉錄序列（mRNA）的資訊，能提供基因功能性與遺傳變異重要的訊息，為構築完整的基因資料庫提供幫助。為了瞭解序列中 DNA 甲基化與表觀遺傳資訊間的關係，研究者進一步利用亞硫酸鹽定序（bisulfite sequencing）來建立 DNA 甲基化圖譜，將 DNA 從單一細胞萃取出，並製作其對應的甲基化資料庫（圖二）。本文作者將基因轉錄組定序法與亞硫酸鹽定序法結合（此方法稱為 single-cell methylome and transcriptome sequencing, scM&T-seq），可以獲得單一細胞中DNA表觀遺傳與轉錄間相互關聯訊息，這樣的技術亦有助於分析有限的臨床樣品。
圖二. 亞硫酸鹽定序法資料庫準備步驟。單一細胞經溶解後DNA被萃取出並與亞硫酸鹽反應標記出甲基化位置，續加入引子 (primer and adaptor) 以聚合酶連鎖反應 (PCR) 放大產物並定序。（圖片來源：https://www.nature.com/articles/nprot.2016.187/figures/1）
為了證實 scM&T-seq 的可行性，本文作者取用 76 個老鼠的胚胎幹細胞。並將細胞培養在血清充足的環境中以建立介穩狀態（metastable, 穩定與不穩定狀態間的平衡） ，意即此環境中，有一定比例但非特定的細胞在進行轉錄作用。接著，作者利用流式細胞儀分離出單一個細胞，並萃取出 mRNA 與 DNA，分別進行放大定序（mRNA）及亞硫酸鹽定序（DNA）（圖三）。由於分離出的單一細胞可能正處於分化或未分化狀態，而其個別狀態又與不同的轉錄因子表現相關，再藉由亞硫酸鹽定序獲得的表觀遺傳變化的訊息，來分析之間的複雜關係。例如，維持幹細胞多功性狀態（pluripotency）的轉錄蛋白 Nanog 之表現量在處於分化狀態的細胞中相較於未分化狀態的細胞中還低，但整體 DNA 的甲基化程度則較高，這意味著，表觀遺傳對調控幹細胞多功性蛋白表現上扮演極重要的角色。因此，藉由 scM&T-seq 一層層的分析與比較，在胚胎幹細胞中存在的轉錄異質性，和 DNA 的表觀遺傳性，可直接與幹細胞分化潛能做對比，建立這三者之間的相對關係。
圖三、scM&T-seq定序步驟。（圖片來源：https://www.nature.com/articles/nmeth.3728/figures/1）
新一代的定序技術不單單僅限於獲得 DNA 序列組合的資訊，配合 DNA 表觀遺傳上的變化與轉錄組基因定序法，共同完成一套完整的基因序列組裝；然而，這都只是一個開始，進一步的分析與解讀才能有效為生物醫學提供線索。例如在癌症醫學上的應用，許多研究報告指出癌細胞中亦存在著擁有類似胚胎幹細胞特性的一群癌幹細胞 (cancer stem cell) ，而表觀遺傳上的變化已被證實與癌幹細胞造成的抗藥性密切相關，若能應用本文的定序法，對比癌細胞、癌幹細胞和正常細胞的不同，相信未來在癌症醫學上亦能提供彌足珍貴的訊息 。
參考資料：
- Angermueller, C. et al. (2016). Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods, 13(3), 229-232. doi:10.1038/nmeth.3728
- Iain C Macaulay., et al. (2015). G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods, 12(6), 519-522. doi:10.1038/nmeth.3370
- Stephen J Clark., et al. (2017). Genome-wide base-resolution mapping of DNA methylation in single cells using single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq). Nature Protocols, 12(3), 534-547. doi:10.1038/nprot.2016.187
作者｜葉意茹
修訂｜蔡京庭
