DNA定序──過去現在與未來

自 1953 年解開 DNA 的構造開始，為瞭解人類基因圖譜點亮了曙光；2003 年，人類基因體計畫宣布完成；2015 年，Veritas Genetics 宣布能以 1000 美元的成本定序一個人的所有基因，基因定序的發展有了飛躍性的成長。然這些定序技術的發展背後，卻是各種科學家的嘗試錯誤和絞盡腦汁，同時也成為了許多科學人茶餘飯後的有趣故事。

回到一開始，剛解開 DNA 構造之時，科學家就有想過要測定其序列，然而當時用在定序蛋白質的方法，用在 DNA 上卻是功敗垂成，因為核酸太長，而且鹼基間的性質太相像。一開始定序也不是針對 DNA，而是針對 RNA，如細菌的 rRNA 或 tRNA，或是噬菌體的單股 RNA 基因，原因很簡單，因為一開始並沒有像 PCR 那樣能大量複製核酸的技術，只好來定序這種大量存在生物體內的核酸。在 1965 年，Robert Holley 等人終於定序了 S. cerevisiae 對應到 alanine 的 tRNA。同時，Fred Sanger 等人發明了一種用放射性標定的 DNA 片段，加上 2D fractionation（電泳＋層析）的方法來定序，初代的 DNA 定序才開始有了雛型。

接下來的改進，在於把 2D 改成只使用電泳來分離 DNA 片段，雖然有了進步，但仍嫌麻煩。最大的躍進在 1977 年，Sanger 使用了聚合鏈終止（chain-termination）方法，此方法使用四種不同的 ddNTPs，因為他們比正常的 dNTP 少了 3’ 端的 OH 基，當 DNA 在聚合時若使用 ddNTPs 會停止延長。藉由在正常的 dNTPs 中加入少量標定過的 ddNTPs，可以聚合出各種不同長度的 DNA，這樣的混合物經過電泳，即可分離出所有的序列。這就是後來最為人所稱道的 Sanger sequencing，直到現在實驗室還會使用，Sanger 當初大概沒想過他會名留青史吧。後來的優化也僅是把標定從放射性物質改成螢光、使用更有效率的聚合酶，以及用毛細管取代電泳等，而基於此原理的定序，就稱作「第一代定序」。

1990 年代，因生科迅速的發展，定序也演化出各種方法，開始進入百家爭鳴的時代。除了利用螢光標定以外，也有人利用了焦磷酸（pyrophosphate）合成時可以透過酵素反應而發光來測定，更有人使用 pH 值改變的差異來測定序列。其中焦磷酸測定的方法，由一家叫 454 Life Sciences 的公司採用，成為第一台商業運轉的定序機器，也在後來的人類基因體計畫中扮演重要的角色。這些異於傳統的定序方法，我們稱之為「第二代定序」，它也有個更科幻的名字：「次世代定序」（Next generation sequencing）。

這些次世代定序的原理，不外乎以下三步：第一，將 DNA 打散成碎片（稱作散彈槍法）。第二，把 DNA 碎片擴增，提高序列能被偵測的濃度，基本上都是使用 PCR，但各家花樣百出（如圖一）。第三，平行定序，同時用機器大量讀取定序資料，再透過機器的演算法（同樣各有各的方法），把序列拼起來。市場上活躍的廠商有：Roche、ThermoFisher、Illumina (Solexa) 等，其中 Illumina 以後起之秀，現在幾乎囊括整個市場。

既然現在有了次世代定序，下一步會是什麼呢？有人認為現在正在邁進「第三代定序」，其特色是：單分子定序（single molecule sequencing, SMS）與即時定序（real-time sequencing）等。單分子定序特點在於省去 DNA 擴增的步驟。目前最夯的是Pacific Biosciences的單分子即時定序（Single molecule Real-time, SMRT），可以在短時間內定序單分子，相較第二代機器別有競爭力。另一個受到矚目的明星是奈米孔定序法（nanopore sequencing），原理是單股 DNA 經過膜上蛋白質孔洞時不同鹼基會產生不同電壓變化，透過偵測其電壓變化來測序。

這幾年來科研的突飛猛進，使定序的進步速度遠超過摩爾定律的 18 個月，達到平均每 5 個月倍增。這一連串機器與技術的進步與定序公司間的軍備競賽，會帶領生科和醫療到什麼樣的高度呢？唯一能確定的是，這波風潮勢不可擋。

 

 

參考資料：

1. Goodwin, S., Mcpherson, J. D., & Mccombie, W. R. (2016). Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 17(6), 333-351. doi:10.1038/nrg.2016.4.
2. Li, W., Notani, D., & Rosenfeld, M. G. (2016). Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics, 17(4), 207-223. doi:10.1038/nrg.2016.4
3. Levy, S. E. & Myers, R. D. (2016). Advancements in Next-Generation Sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 17, 95-115. doi:10.1146/annurev-genom-083115-022413
4. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8. doi:10.1016/j.ygeno.2015.11.003

 

撰文｜紀威佑
修訂｜蔡京庭