基因與基因體學 基因體學 生物化學 跨領域生物科技

DNA定序──過去現在與未來

自 1953 年解開 DNA 的構造開始,為瞭解人類基因圖譜點亮了曙光;2003 年,人類基因體計畫宣布完成;2015 年,Veritas Genetics 宣布能以 1000 美元的成本定序一個人的所有基因,基因定序的發展有了飛躍性的成長。然這些定序技術的發展背後,卻是各種科學家的嘗試錯誤和絞盡腦汁,同時也成為了許多科學人茶餘飯後的有趣故事。

回到一開始,剛解開 DNA 構造之時,科學家就有想過要測定其序列,然而當時用在定序蛋白質的方法,用在 DNA 上卻是功敗垂成,因為核酸太長,而且鹼基間的性質太相像。一開始定序也不是針對 DNA,而是針對 RNA,如細菌的 rRNA 或 tRNA,或是噬菌體的單股 RNA 基因,原因很簡單,因為一開始並沒有像 PCR 那樣能大量複製核酸的技術,只好來定序這種大量存在生物體內的核酸。在 1965 年,Robert Holley 等人終於定序了 S. cerevisiae 對應到 alanine 的 tRNA。同時,Fred Sanger 等人發明了一種用放射性標定的 DNA 片段,加上 2D fractionation(電泳+層析)的方法來定序,初代的 DNA 定序才開始有了雛型。

接下來的改進,在於把 2D 改成只使用電泳來分離 DNA 片段,雖然有了進步,但仍嫌麻煩。最大的躍進在 1977 年,Sanger 使用了聚合鏈終止(chain-termination)方法,此方法使用四種不同的 ddNTPs,因為他們比正常的 dNTP 少了 3’ 端的 OH 基,當 DNA 在聚合時若使用 ddNTPs 會停止延長。藉由在正常的 dNTPs 中加入少量標定過的 ddNTPs,可以聚合出各種不同長度的 DNA,這樣的混合物經過電泳,即可分離出所有的序列。這就是後來最為人所稱道的 Sanger sequencing,直到現在實驗室還會使用,Sanger 當初大概沒想過他會名留青史吧。後來的優化也僅是把標定從放射性物質改成螢光、使用更有效率的聚合酶,以及用毛細管取代電泳等,而基於此原理的定序,就稱作「第一代定序」。

1990 年代,因生科迅速的發展,定序也演化出各種方法,開始進入百家爭鳴的時代。除了利用螢光標定以外,也有人利用了焦磷酸(pyrophosphate)合成時可以透過酵素反應而發光來測定,更有人使用 pH 值改變的差異來測定序列。其中焦磷酸測定的方法,由一家叫 454 Life Sciences 的公司採用,成為第一台商業運轉的定序機器,也在後來的人類基因體計畫中扮演重要的角色。這些異於傳統的定序方法,我們稱之為「第二代定序」,它也有個更科幻的名字:「次世代定序」(Next generation sequencing)。

這些次世代定序的原理,不外乎以下三步:第一,將 DNA 打散成碎片(稱作散彈槍法)。第二,把 DNA 碎片擴增,提高序列能被偵測的濃度,基本上都是使用 PCR,但各家花樣百出(如圖一)。第三,平行定序,同時用機器大量讀取定序資料,再透過機器的演算法(同樣各有各的方法),把序列拼起來。市場上活躍的廠商有:Roche、ThermoFisher、Illumina (Solexa) 等,其中 Illumina 以後起之秀,現在幾乎囊括整個市場。

既然現在有了次世代定序,下一步會是什麼呢?有人認為現在正在邁進「第三代定序」,其特色是:單分子定序(single molecule sequencing, SMS)與即時定序(real-time sequencing)等。單分子定序特點在於省去 DNA 擴增的步驟。目前最夯的是Pacific Biosciences的單分子即時定序(Single molecule Real-time, SMRT),可以在短時間內定序單分子,相較第二代機器別有競爭力。另一個受到矚目的明星是奈米孔定序法(nanopore sequencing),原理是單股 DNA 經過膜上蛋白質孔洞時不同鹼基會產生不同電壓變化,透過偵測其電壓變化來測序。

這幾年來科研的突飛猛進,使定序的進步速度遠超過摩爾定律的 18 個月,達到平均每 5 個月倍增。這一連串機器與技術的進步與定序公司間的軍備競賽,會帶領生科和醫療到什麼樣的高度呢?唯一能確定的是,這波風潮勢不可擋。

 

圖一、各式各樣的 DNA 碎片擴增原理 (圖片來源:https://www.nature.com/articles/nrg.2016.49/figures/1

 

參考資料:

  1. Goodwin, S., Mcpherson, J. D., & Mccombie, W. R. (2016). Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 17(6), 333-351. doi:10.1038/nrg.2016.4.
  2. Li, W., Notani, D., & Rosenfeld, M. G. (2016). Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics, 17(4), 207-223. doi:10.1038/nrg.2016.4
  3. Levy, S. E. & Myers, R. D. (2016). Advancements in Next-Generation Sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 17, 95-115. doi:10.1146/annurev-genom-083115-022413
  4. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8. doi:10.1016/j.ygeno.2015.11.003

 

撰文|紀威佑
修訂|蔡京庭

About the author

紀威佑

紀威佑

臺大醫學系畢業,曾為臺大iGEM代表隊成員,曾於台大、中研院、AMC實驗室進行實習。對科普推廣與寫作有很大的興趣,希望能和志同道合的朋友交流,並做為知識的傳播者為科學社群盡一份心力。