TIMES 雜誌 2016 年度風雲人物的票選結果中，研究 CRISPR 的先鋒學者們僅次於美國總統川普，差那麼一點點就成為封面人物了。如今愈來愈多科學家致力於將基因編輯技術推向臨床應用，火紅的程度以及對未來的影響力是我們可以想見的。
Cas9 靶向基因編輯雖然具有應用潛力，但是相關的工具在體內的基因整合效率目前還是太低，特別是在非分裂細胞中。在成人組織中非分裂細胞佔了絕大多數，這無疑會對基因編輯的進程產生阻礙。為了順利克服這項困難，由 Salk Institute 為首的國際團隊研發出了一種新的基因編輯方式。不論在體內或體外都能將目標基因（Gene of interest, GOI）嵌入細胞中（Knock-in）。透過恢復視覺受損老鼠部分視力，團隊亦向世人證明了此技術的臨床應用潛力。
在 Cas9 進行基因編輯時，DNA 的嵌入必須經過雙股斷裂（Double strand break, DSB）而其修復方式大致上分為兩種，其一是同源基因引導的修復（Homology-directed repair, HDR），另一種則是非同源的末端連接（Nonhomologous end joining, NHEJ），顧名思義兩者最大的不同就是在有無同源基因的導入。雖然HDR 比 NHEJ 來得精準，但是 HDR 效率比較低且需要同源基因的參與，必須是在進行細胞分裂的狀況下才能順利進行。相對的 NHEJ 雖然被視為容易出錯的方式，但是效率較高且不受細胞週期限制。 於是團隊設計了一種基於 NHEJ 修復途徑的基因編輯方式，他們稱作同源獨立性標靶基因整合（Homology-independent targeted integration, HITI, 圖一）。
在體外測試方面，團隊利用 GFP-correction HEK293 細胞株證實了 HITI 嵌入目標基因的效率較其他方式高出許多。隨後團隊針對小鼠初代神經元進行測試，在轉染成功的細胞中也看到了近 55.9% 的目標基因嵌入。團隊接下來利用子宮內的電穿孔方式對胎鼠腦進行 HITI 基因編輯的體內測試。結果顯示出生三週後的鼠腦，有目標基因表現的受轉染細胞占 16.8% 。針對非分裂神經元團隊利用相同方式進行基因轉染，並使用了需要 Tamoxifen（TAM）才能誘發表現的 Cre-dependent Cas9 基因。如此一來可以在老鼠出生且大部分神經祖細胞已分化分裂完全的時候，再以 TAM 誘發 Cas9 表現。此結果發現在非分裂細胞 HITI donor 能有效地將目標基因嵌入，然而 HDR donor 卻幾乎無效。團隊也透過其他實驗證實除了大腦外，在其他含非分裂細胞的組織，例如：肌肉和腎臟等組織，亦能透過 HITI 進行基因編輯。
著墨 HITI 應用功效，團隊利用 Adeno-associated Virus（AAV）為載體遞送 Cas9 和目標基因 GFP，並使之成功嵌入到目標位置（Tubb3）上。確定方法可行後，他們將帶有 Cas9 和目標基因的病毒載體直接注射到成鼠大腦的視覺皮層中，並於兩週後觀察到 10.6% 的受轉導細胞有 GFP 表現。探討 HITI 基因置換的療效，科學家進一步地在視網膜色素變性的鼠模型中（Royal College of Surgeons Rat）， 嘗試修復原本不完整的 Mertk 基因。Mertk 基因中的 exon 2藉由 HITI 置入後，除成功表現 Mertk 蛋白外還可以有效保持視網膜中的外核層厚度（圖二）。透過視網膜電圖檢視身理反應的功能更證實了 HITI 確實能有效置入目標基因並達到一定療效，雖然並非 100% 復原，但是結果確實令人振奮。
本篇通過基因編輯工具 CRISPR 精確地將 DNA 插入缺陷基因，改善了視覺受損的大鼠視力。研究也闡明了 CRISPR 可以在多數已是非分裂細胞的成人組織的中進行基因編輯。過去 NHEJ 通常被用於削弱或移除基因，但是團隊聰明地應用了它的好處並研發了一種創新的方式來嵌入基因 。 最後，隨著技術不斷地進步，CRISPR 真正能治療基因缺陷病症可以說是指日可待。
圖一：Extended Data Fig. 1a 圖二：Fig. 3f-g ＆《 Anatomy of the Human Body》 圖片來源：https://goo.gl/QMYKPg
參考資料：
- Amazing genetic breakthrough could restore sight, and possibly extend the human lifespan. (n.d.). https://goo.gl/1gOKGI
- Science news：Gene editor CRISPR restores some sight in vision-damaged rats.
https://goo.gl/Aq7jys - MIT news：Feng Zhang named a runner-up for TIME’s 2016 Person of the Year.
https://goo.gl/gIMVqs
撰文｜張智鈞
修訂｜蔡京庭
