結合微流道與條碼 · 解析單一細胞基因表現

每顆細胞之間皆存在差異性，即使是相同種類的一群細胞也不例外。然而有礙於實驗技術的限制，一般傳統的實驗方法只能以一群細胞所萃取的 RNA 來測定基因表現，因此研究人員無從得知這群細胞之間是否存在差異性。隨着次世代基因定序技術（next generation sequencing）的出現，高通量定序檢測細胞基因表現成為可能，但研究人員卻面對另一個技術瓶頸——要如何快速、大量地分離單一細胞（single cells），並從單一細胞層次獨立檢測細胞的基因表現呢？

哈佛大學的研究團隊為上述問題提供了一個解決方案——使用微流道液滴（droplet microfluidic）技術來處理細胞 [1]。此技術可透過微流道將單細胞獨立地包穀在單一液滴中，每一顆液滴內皆提供反轉錄（reverse transcription）所需的化學試劑以及水膠（hydrogel）所構成的小珠。每一顆水膠小珠（hydrogel beads）中皆含有不同序列組合的聚合酶鏈反應引子（PCR primers）以作為標示不同單一細胞的條碼（barcode）。每一顆液滴即可代表一次單一細胞實驗。單一細胞在液滴中溶解，RNA被反轉錄成對股DNA（complementary DNA, cDNA），且這些對股DNA皆帶有獨特的單細胞條碼。經過微流道液滴處理後的對股DNA樣本再以次世代定序技術進行定序，即可透過條碼追蹤一群細胞中每一顆單一細胞的基因表現。

透過這項高通量單一細胞標記（High-Throughput Single-Cell Labeling, Hi-SCL）的技術突破 [2]，不同的研究團隊將之運用在老鼠胚胎幹細胞（mouse embryonic stem cells）、視網膜（retina）[3]、胚胎纖維母細胞（embryonic fibroblasts）的研究上。這項新穎的實驗技術目前仍有其侷限，少部份的滴液會包裹到兩個或以上的細胞，且可能無法偵測到細胞中表現量極低的信使RNA（messenger RNA），然而這樣的誤差已足夠分別樣本中不同的細胞種群（cell populations）。從44808顆老鼠視網膜細胞液體的定序結果中，這些視網膜細胞被分群成39種不同的細胞種群。看起來相同的935顆老鼠胚胎幹細胞也被分成了數種離散狀態（discrete state）而非之前所認為的兩種狀態。

仰賴這項單一細胞層級轉錄體（single cell transcriptomic）技術，科學家能夠更深入地探討單一細胞與細胞之間的異質性（heterogeneity）。期待更多原先面對技術瓶頸而無法研究的生物問題因此技術的開發而被解答。

撰文｜陳恩浩
審稿｜邱亮源
修訂｜藍冠鈞

參考資料：
[1] Klein, A., Mazutis, L., Akartuna, I., Tallapragada, N., Veres, A., Li, V., … Kirschner, M. (2015). Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell, 161(5), 1187-1201. doi:10.1016/j.cell.2015.04.044
[2] Rotem, A., Ram, O., Shoresh, N., Sperling, R. A., Schnall-Levin, M., Zhang, H., … Weitz, D. A. (2015). High-Throughput Single-Cell Labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq Using Drop-Based Microfluidics. PLOS ONE, 10(5), e0116328. doi:10.1371/journal.pone.0116328
[3] Macosko, E., Basu, A., Satija, R., Nemesh, J., Shekhar, K., Goldman, M., … McCarroll, S. (2015). Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell, 161(5), 1202-1214. doi:10.1016/j.cell.2015.05.002