去去蚊子走–利用 CRISPR-Cas9 基因驅動系統讓雌性瘧蚊不孕

在 2015 年，全球仍約有一半的人口暴露在感染瘧疾的風險之下，包含了約 91 個國家和地區。雖然現今已有藥物能夠治療瘧疾（從廣為人知的奎寧到 2015 年諾貝爾獎得主屠呦呦發現的青蒿素），但仍有抗藥性等潛在的問題。因此隨著基因工程的發展，從最根本減少瘧原蟲的傳播或是減少瘧蚊的數量成為新興的解決方案。

本篇研究即是由來自英國倫敦帝國學院的團隊，利用基因編輯方法 CRISPR-Cas9 建構的基因驅動（gene drive）系統使瘧疾的主要宿主甘比亞瘧蚊（Anopheles gambiae）產出不孕的雌蚊後代。本篇研究的共同作者之一 Austin Burt 早在 2003 年就提出可以利用合成的基因驅動系統來散布特定的特徵到群體之中，當時這個概念是由 homing endonuclease genes（HEG）啟發而來。 HEG 是一種自私基因片段（selfish gene element），它產生的蛋白可以辨識並切除同源染色體 15-30 個鹼基的基因片段，然後利用同源染色體修復的方式（homologous chromosome repair），將 HEG 片段修補到該股染色體，使得兩股染色體都帶有 HEG，從異型合子變成同型合子，也就是 “homing” 的概念。透過這個機制， HEG 在族群中的基因頻率便可大幅的提升，打破傳統的孟德爾遺傳定律。而這也就是基因驅動的概念，讓特定基因遺傳至下一代的機率大增。將這個概念運用於實務上，我們能夠控制傳播疾病的昆蟲載體，以瘧疾為例，可以增加瘧蚊群體對瘧原蟲抗性或直接降低瘧蚊群體的生育力來防止疾病的傳播。

自從這個概念提出後，科學家們做了各項實驗希望能真正控制昆蟲載體族群，他們使用了其他的核酸酶，如鋅指核酸酶（zinc finger nuclease）和 TALEN（transcription activator-like effector nuclease）等可以辨識特定位置的核酸酶來建構基因驅動系統，可惜的是複製保真度（replication fidelity）不佳。直到 2012年， CRISPR-Cas9 這個高效率且高精準度的基因編輯方法出現，情況才大為改觀。而本篇研究團隊首先利用 CRISPR 或 TALEN 加上綠色螢光蛋白標記來確認三個候選基因- AGAP005958, AGAP011377, AGAP007280。這些候選基因確實是能影響甘比亞瘧蚊雌蚊生育力的隱性基因，只有同型合子的突變雌蚊會不孕，而對雄蚊和異型合子的雌蚊則沒有影響。接著他們利用 RMCE（Recombinase-mediated cassette exchange） 的方式將基因驅動載體 CRISPR homing allele（CRISPRh）插入雄蚊和雌蚊染色體中這三個基因相對的目標位置。此基因驅動載體帶有

(i) 由 vasa 2 promotor 控制的 Cas 9 核酸酶
(ii) U6 promotor + 嚮導RNA（gRNA）序列:設計來主導核酸酶的切割能力
(iii) 紅色螢光蛋白 RFP :作為視覺辨識標記來確認瘧蚊是否帶有此載體

同樣藉著 homing 的概念使野生種序列也得到 CRISPRh 載體。而 CRISPRh 傳遞給子代的機率約從91.4%到99.6%。由產出的卵數量以及孵化成功的幼蟲數來看，有著 CRISPRh 異型合子雌蚊確實有生育力下降的狀況。而帶有 CRISPRh 異型合子的雄蚊其生育力則沒有受到影響。最後，藉由 Deredec 論文中的模型來進行族群推算以及籠中試驗(將同數量的野生種蚊子和基因驅動的蚊子一起飼養，使其產出的子代再互相交配)顯示出針對 AGAP007280 調控的蚊子，在經過 4 個世代後，有 75.1% 的子代帶有 CRISPRh 載體，是最有希望成為控制瘧蚊族群的標的，既能夠使瘧蚊族群不孕又能不至於付出太大的適存性代價（fitness cost）使得植入基因得以傳承下去。

此篇研究顯示了人類可成功運用基因驅動系統作為瘧蚊數量控制的利器，然而這個方法會對生態系統造成極大的影響且造成倫理問題，因此是否能真正運用於在自然環境中仍有爭議。不過此項研究還是為消滅瘧疾帶來了新希望！