在冷戰時期的太空競賽中，女數學家 Katherine Johnson 跳脫眼前既存的數學公式，在數據間看到真理，完成了將人類送上太空的艱鉅任務，成為重大歷史事件的「關鍵少數」。在基因體科學中，科學家們也將眼界從尋找致病基因，放大到染色體中無法製造出蛋白質，看似毫無作用的非編碼 DNA（non-coding DNA），希望在框架之外，聽見基因密碼中的對話。
Broad Institute 的 Fulco et al. [1] 在 2016 的 Science 中，利用最新的 CRISPRi 技術，成功找到控制兩個骨髓性血癌致病基因 GATA1 與 MYC 的非編碼基因片段。研究團隊系統性的建立針對 GATA1 與 MYC 附近 DNA 片段的 single guide RNAs（sgRNAs）library，並利用 KRAB-dCas9 改變染色體的結構，達到專一性的抑制作用。為了量化研究結果，作者觀察 K562 血癌細胞的增殖狀況，並將目標序列連續的 20 個 sgRNA 的細胞增殖實驗結果平均，找到影響細胞生長最顯著的基因控制序列。
在控制GATA1基因表現的實驗中，作者找到兩個影響最大的基因密碼，一個是GATA1本身 enhancer（e-GATA1）；另一個卻是在 GATA1 基因下游，活化基因表現的重要組蛋白去乙醯酶 Histone deacetylase 6（HDAC6）的 enhancer（e-HDAC6），利用 CRISPRi 改變 e-GATA1 或 e-HDAC6 的染色體構型，都可以達到抑制 GATA1 基因表現的效果，進而抑制癌症細胞的生長。乍看之下，GATA1 與 HDAC 似乎擁有共同的 enhancer，故為了更加了解 GATA1 與 HDAC6 的交互作用，研究團隊分別抑制 GATA1 與 HDAC6 的啟動子（promoter），驚人的是，當抑制 GATA1 時，HDAC6 的表現量上升，反之亦然。由此結果，可以得知基因之間藉由非編碼序列（non-coding elements）形成緊密的訊息網路。
在控制 MYC 基因表現的實驗中，研究利用相同的方法，找到影響 MYC 基因表現的七個 enhancer。為了檢測此 CRISPRi 檢測方法的準確性，Fulco et al. 特別利用 CRISPR 降低與 MYC promoter 有接觸，但卻在此檢測方法中未有顯著結果的 DNA 片段 NS1 的表現量，實驗結果顯示，儘管 NS1 可以改變 MYC 的染色體構型，但卻未實質影響 MYC 的基因表現和 K562 血癌細胞，進而揭示，CRISPRi 檢測方式除了反映基因密碼間的對話，更能有效預測 non-coding element 對目標基因的控制能力。
然而，若不停地利用 CRISPRi 方式分析各個基因的交互作用，未免過於耗時耗力，故文章中利用 MYC 的實驗結果，歸納出只要綜合三種指標：DNase I Hypersensitive Site（DNS）、Histone 3 上第 27 個蛋白質lysine 的乙醯化程度（H3K27ac）和 Hi-C data，就能系統性的剖析影響基因表現的 non-coding elements。其中，DNS 與 H3K27ac 反應該 non-coding element 本身的活性；Hi-C data 則代表此序列跟基因 promoter 的作用程度。藉由此三個指標，作者成功的預測出影響膀胱癌、淋巴癌與身高表現的單一核苷酸多形性（single nucleotide polymorphism，SNP ）。非編碼 DNA 序列（non-coding DNA〉多而龐雜，相信結合CRISPRi以及DNS、H3K27ac、Hi-C data，可以更加釐清基因的轉錄脈絡，找到影響深遠的關鍵少數。
圖一、利用 CRISPRi 技術系統化的找出調控 GATA1 的非編碼基因片段（圖片來源：: https://goo.gl/emtgsU）
參考資料：
- Fulco, C.P., et al. (2016) Systematic mapping of functional enhancer–promoter connections with CRISPR interference. Science, 354(6313), 769-773. doi: 10.1126/science.aag2445
撰文│張彥安
修訂│蔡京庭
