本月份的主題再次回來探討定序技術，我們將焦點放在近幾年逐漸從理論走向實用的第三代定序（長片段定序 third generation sequencing, long read sequencing），向各位讀者介紹現有的定序平台、分子診斷、對基因體學研究的影響。定序方法不斷演進，次世代定序（next generation sequencing）已經成功作為基因體、轉錄體研究的必要技術十幾年，定序基因體所需的花費甚至迅速降低，遠快於摩爾定律 (Moore’s law) 的預期。其特徵為：使用 PCR 或 DNA 連接酶為基礎，在晶片或球珠（beads）表面同時進行大量 DNA 片段合成／接合，再接收光線訊號，最後轉換為核苷酸的種類與正確機率。然而，次世代定序面臨好幾個先天限制。次世代定序的 DNA 片段偏短，以 illumina NovaSeq 6000 為例，定序長度局限於 150 bp，因此較難處理大尺度的基因體結構變化。因為定序片段較零碎，故需要重複定序大量片段以獲得足夠的覆蓋率，這類動輒數個 terabytes 的巨量資料，得依賴深奧的分析技術與高階電腦輔助，才有較高的機會組裝出完整的基因體。針對頻率較低或未知的序列變化，常常面臨偽陰性的問題。前述多個限制會在定序全新基因體（de novo sequencing）的時候更加顯著。
第三代定序的概念與方法，約在 10 年前應運而生，其核心方法著重於直接定序單一分子，避免將 DNA 震碎成小片段；若針對 DNA 的表觀遺傳修飾，也能省略建立定序基因庫 （library）的階段，故能夠避免 PCR error。第三代定序能夠直接面對至少 10,000 bp 的 DNA 分子，提供較大尺度的序列資訊，這在富含重複片段的區域（例如中節、端粒、植物基因體）較次世代定序占優勢，也能夠協助次世代定序資料的組裝，降低組裝短片段、haplotype phasing 的困難。當然，第三代定序並非無懈可擊，正確率、通量（throughput）為其弱點。近幾年，科學家努力改善定序技術，或嘗試改善錯誤率，或嘗試運用演算法或定序策略校正，已有幾個定序策略可進行商業服務，這讓第三代定序的應用越來越廣泛。
期待這系列文章能讓讀者一窺第三代定序的面貌與現今應用。
圖片來源：https://www.genome.gov/27541954/dna-sequencing-costs-data/
撰文│王振宇
審稿│楊仁龍
