第三代定序 — SMRT 技術及原理

由太平洋生物科學公司 (Pacific BioSciences) 所開發的第三代定序技術 PacBio sequencing 亦可稱為 single-molecule real-time (SMRT) 定序，其最主要的特徵是即時 (real-time) 測定長片段之 DNA 鹼基序列。

SMRT 技術得以實現有賴於 zero-mode waveguide (ZMW) 技術之成熟。ZMW 是一個僅有 20 zeptoliter (10^-21 liter) 之大小的孔洞，此空間僅容納數個分子，故可以做到單一 DNA 長鏈定序。透過將 ZMW 表面進行化學修飾後，使得 DNA 聚合酶 (polymerase) 可以被放置於 ZMW 中，當 DNA 聚合酶進行聚合反應時利用光源以毫秒 (millisecond) 快速的進行照射，可以減少螢光訊號損失並可即時 (real-time) 偵測 DNA 聚合時產生的螢光。此外，DNA 聚合時可以透過分析不同的脈衝間的持續時間 (interpulse duration)，如：DNA 聚合酶遇到甲基化的鹼基時，進行 DNA 聚合時核苷酸之間兩個螢光訊號之波長可能會延遲，即可知曉序列上是否有 DNA 修飾等。[1,2]

然而，如此強大的 SMRT 技術卻被揭露會產生大約是 13% 的隨機產生的定序錯誤分散在序列中。因此，他們透過在預定序的 DNA 兩端加入一致性序列形成環狀 DNA，使得 DNA 可被反覆被定序透過提高覆蓋率，並以演算法比對一致性 DNA 序列可用來修正並使得定序上  DNA 單次通過時的定序錯誤率 (single pass error rates) 下降。

SMRT 技術相較於次世代定序僅能定序約 300 – 500 bp 的 DNA 片段， SMRT 技術則可以定序平均長度約為 15,000 bp 的 DNA 片段，此長片段定序可以降低基因組在組裝時因高度重複序列、高度結構複雜及富有變化性序列所造成基因體組裝上的錯誤。但在其低通量及高成本則是仍是需克服的問題。

在 2018 年 11月，次世代定序的龍頭 Illumina 宣布將要以 12 億美元收購 Pacific BioSciences [3]，使得擅長短片段定序的 Illumina 可以借此補足DNA長片段定序之技術。透過此舉我們可以了解目前次世代定序已經滿足不了基因體定序的需求。而 Illumina 可透過 SMRT 技術解決短片段定序無法克服的問題，而 SMRT 技術則需要次世代定序解決其通量低及成本過高的問題，亦顯示第三代定序技術仍需要有更進一步的發展才能取代次世代定序，且第三代定序具有相當大的發展潛力。

 

1.  Zhu, P., & Craighead, H. G. (2012). Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis. Annual Review of Biophysics, 41(1), 269-293. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-050511-102338

2. Ardui, S., Ameur, A., Vermeesch, J. R., & Hestand, M. S. (2018). Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic Acids Research, 46(5), 2159-2168. doi: 10.1093/nar/gky066

3. Illumina to Acquire Pacific Biosciences for Approximately $1.2 Billion, Broadening Access to Long-Read Sequencing and Accelerating Scientific Discovery – PacBio. (n.d.). Retrieved from https://www.pacb.com/press_releases/illumina-to-acquire-pacific-biosciences-for-approximately-1-2-billion-broadening-access-to-long-read-sequencing-and-accelerating-scientific-discovery/

撰文│ 楊仁龍
審稿│ 林偉強