第三代定序— Helicos 技術及原理

從 1977 年，Sanger 改進了定序並發明了為人稱道的 Sanger sequencing，到 1990 年代，次世代定序逐漸嶄露頭角，再到 2010 年代的第三代定序，其發展可說相當迅速。【DNA定序──過去現在與未來】

和次世代定序的大量平行定序不同，第三代定序的賣點在於單分子定序。其中最為人所知的方法包含 Pacific Biosciences 的單分子即時定序（single molecule real time sequencing, SMRT）、Oxford Nanopore Technology 的奈米孔定序法（nanopore sequencing），以及 Helicos Biosciences 的單分子螢光定序法（single molecule fluorescence sequencing）。我們在前一篇文章已經介紹過 SMRT 的技術及原理，這篇要來介紹的是 Helicos 的單分子螢光法。

介紹之前，先來點八卦吧。雖說是 Helicos Biosciences 所開發之技術，但在 2012 年 Helicos Biosciences 申請破產 [1]，隨後便將此技術的專利授權給深圳瀚海基因（Direct Genomics）以及在 2013 年成立的 SeqLL [2,3]。而瀚海基因的三位創辦人之一就是最近因為使用 CRISPR 技術修改嬰兒基因而惡名昭彰的賀建奎（Jiankui He），在 2012 年為 Helicos Biosciences 老闆 Stephen Quake 底下的博士後研究員。

進入正題，他們使用的單分子螢光定序法到底是怎麼運作的呢？首先，他們採用合成式定序 （sequencing by synthesis）。簡單來說，將細胞 DNA 打散成 100-200 bp 的大小，利用末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）在 DNA 的 3’ 端接上帶有螢光標記的脫氧腺苷三磷酸苷（dATP）形成的 poly-A 尾端。偵測晶片上則是鋪滿數十億條與之配對的 poly-T。當晶片上的 poly-T 與樣本 DNA 的 poly-A 尾端配對後，以雷射激發螢光並紀錄亮點，隨即移除螢光標記。之後加入帶有螢光標記之核苷酸，配對合成後，移除試劑，並以雷射激發螢光並紀錄亮點，再移除標記。重複這個過程，依序循環加入帶有螢光標記之 dATP→dCTP→dGTP→dTTP，最終便能夠定序每條 DNA 片段。此過程大約會重複 120 次，相當於 30 個循環，每次循環可產生 35Gb 的 DNA 定序數據。最後，以電腦處理這些龐大的定序資料，並對照參考基因體（reference genome），把基因體像拼圖一樣拼起來，即大功告成 [4]。

值得一提的是，加入的核苷酸使用了稱作 Virtual Terminator 的技術，用來避免一次合成超過一個鹼基的情況（例如： DNA 片端上有連續的 A，不會因為你加入 T 就在一回合內把全部的 A 都給配對完了）[5]。有興趣的人，請觀看下方影片。

 

這個方法的優點在於，它不像次世代定序需要先以 PCR 擴增 DNA 片段再定序，故能夠避免擴增過程中產生的錯誤，同時也節省了許多時間。但其缺點也是顯而易見：重複的洗去試劑、移除螢光標記的過程實在是太浪費試劑了！此外，較高的粗錯誤率（3-5%）需要靠重複定序來降低，無疑增加了成本。最後，在大量定序上，第三代定序的平均價格上比不過次世代定序，因此他要在市場上嶄露頭角勢必要尋找別的賣點。所謂商場如戰場，存活下來的就是贏家。今年 11 月才傳出定序龍頭 Illumina 要以 12 億美元併購 PacBio 的消息 [6]。且讓我們耐心等待最後誰能在這場定序競爭中勝出。

最後放個三家第三代定序的比較表 [7-9]

公司	SeqLL (Helicos)	Pacific Biosciences	Oxford Nanopore
技術平台	True single molecule sequencing (tSMS)	Single molecule real time sequencing (SMRT)	MinION
DNA 讀取長度	30 bp（最大 55bp）	3,000-15,000 bp（最大 60kb）	最大 230-300 kb
單次最大資料量	35 Gb	1-7 Gb/cell	42 Gb
單次反應產生讀數	~十億	5.5-37 萬	440 萬
定序時間	最多 8 天	0.5-6 小時	兩天內
粗錯誤率	3-5%	13-15%	2-13%

參考資料：

1. Helicos BioSciences Files for Chapter 11 Bankruptcy Protection https://www.genomeweb.com/sequencing/helicos-biosciences-files-chapter-11-bankruptcy-protection#.XAaRX2gzaHs
2. 瀚海基因（Direct Genomics）http://www.directgenomics.com/index.php
3. SeqLL. http://seqll.com/
4. Ari, Sule & Arıkan, Muzaffer. (2016). Next-Generation Sequencing: Advantages, Disadvantages, and Future. 109-135. 10.1007/978-3-319-31703-8_5.
5. Bowers, J., Mitchell, J., Beer, E., Buzby, P. R., Causey, M., Efcavitch, J. W., … Thompson, J. F. (2009). Virtual terminator nucleotides for next-generation DNA sequencing. Nature Methods, 6(8), 593-595. doi:10.1038/nmeth.1354 https://www.nature.com/articles/nmeth.1354
6. Illumina to Acquire Pacific Biosciences for Approximately $1.2 Billion, Broadening Access to Long-Read Sequencing and Accelerating Scientific Discovery – PacBio. (2018, November 1). Retrieved from https://www.pacb.com/press_releases/illumina-to-acquire-pacific-biosciences-for-approximately-1-2-billion-broadening-access-to-long-read-sequencing-and-accelerating-scientific-discovery/
7. Ozsolak, F. (2012). Third-generation sequencing techniques and applications to drug discovery. Expert opinion on drug discovery, 7(3), 231-43.
8. Yeh, C., Liu, Z., & Tsai, W. (n.d.). Advanced Applications of Next-Generation Sequencing Technologies to Orchid Biology. In Next-generation sequencing and bioinformatics for plant science. Retrieved from doi.org/10.21775/cimb.027.051
9. 李思元、莊以光（2010）。DNA 定序技術之演進與發展。生物醫學暨檢驗雜誌，22(2)，49-57。

撰文│紀威佑
審稿│楊仁龍