三代定序再度掀起革命：從頭定序（de novo sequencing）

一般進行定序時，通常需要將定序結果和一個稱作「參考基因體」（reference genome）的資料庫做比對，想像你在拼拼圖的時候，需要將每片拼圖和完成圖進行比對才會比較容易拼完，尤其當拼圖多達數十億片時，這個過程更是必要。舉例來說，人類的參考基因體自從人類基因體計畫完成後持續更新，到 2017 年底已經更新到了第 38 版（GRCh38.p12）[1]。

圖、長序列定序有利於解決上述問題（圖片來源：https://doi.org/10.1101/048603 CC-BY–NC 4.0）

從頭定序（de novo sequencing），是指不使用參考序列（reference sequence）來組裝定序結果。為什麼需要這樣做呢？主要原因是現行的參考序列並不是完整的，中間有許多空洞需要填補與更新。次世代定序雖然方便，但其較短的定序長度限制了定序組裝的結果，尤其以基因體內重複及缺失的片段更加明顯。【詳見 De novo assembly──人類基因體補完計畫】

第三代定序中的單分子即時定序（single molecule real time sequencing, SMRT），為這個問題提供突破點。相較於次世代定序多把 DNA 打散成數百鹼基對的大小，SMRT 技術的定序長度可達約 3,000 到 15,000 鹼基對 (bp)，最長可達 60 kb。這就好像你拼相同的拼圖，SMRT 的拼圖片硬是比次世代定序的大上了數十倍，使得拼圖難度直直下降。SMRT 在偵測到人類基因體中約 40 萬個小片段序列插入／刪除變異（indel variants，定義為小於 50 bp 的變異）和兩萬個結構性變異（structural variants，定義為 50 bp 以上的變異），其中超過 80% 的變異是難以用次世代定序等短序列定序達成的 [2]。

Pacific Biosciences (PacBio) 在 2013 年的研究指出，SMRT 在從頭定序的表現優於二代定序 [3]。為了證明自家產品的強大，2016 年 PacBio 和冷泉港與巴斯德研究院的科學家合作，以 SMRT 從頭組裝了惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）的基因體——將他 14 個核染色體從一邊的端粒拼到另一端。其定序長度平均為 12 kb，其中有一半介於15.5 到 50 kb [4]。在2018 年，PacBio 從頭定序了一位波多黎各女性，產生 2.83 Gb 大小的基因體，中間的間斷（gap）僅有 511 個，並且能區分出來自雙親的兩套染色體。雖然完整度還比不上 GRC 的資料庫（約 3.10 Gb 大小、349 個間斷），但這無疑地貢獻了該地區族群的基因多樣性，同時展現了他們強大的火力 [2]。

近年來 SMRT 展露頭角，越來越多研究者使用 SMRT 輔助次世代定序的結果，用以組裝定序結果的演算法也是越來越精良 [5]，想必未來前途光明。

參考資料：

GRCh38.p12 – Genome – Assembly – NCBI. (2017, December 21). Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.38
Pacific Biosciences Releases Highest-Quality, Most Contiguous Individual Human Genome Assembly to Date – PacBio. (n.d.). Retrieved from https://www.pacb.com/press_releases/pacific-biosciences-releases-highest-quality-most-contiguous-individual-human-genome-assembly-to-date/
Chin, C.-S., Alexander, D. H., Marks, P., Klammer, A. A., Drake, J., Heiner, C., … Korlach, J. (2013). Nonhybrid, finished microbial genome assemblies from long-read SMRT sequencing data. Nature Methods, 10(6), 563–569. doi:10.1038/nmeth.2474
Vembar, S. S., Seetin, M., Lambert, C., Nattestad, M., Schatz, M. C., Baybayan, P., Scherf, A., … Smith, M. L. (2016). Complete telomere-to-telomere de novo assembly of the Plasmodium falciparum genome through long-read (>11 kb), single molecule, real-time sequencing. DNA research, 23(4), 339-51.
Chaisson, M. J. P., Wilson, R. K., & Eichler, E. E. (2015). Genetic variation and the de novo assembly of human genomes. Nature Reviews Genetics, 16(11), 627–640. doi:10.1038/nrg3933