第三代定序 — Oxford nanopore 技術及原理

提到三代定序，不外乎指 Pacific BioSciences (PacBio) 的單分子即時定序（single-molecule real-time sequencing, SMRT）以及 Oxford Nanopore Technologies 的奈米孔定序（nanopore-based platform）。其優點在於能夠讀取較長序列、提高連續序列片段長度、定序速度快，且能直接對原始 DNA 樣本進行定序，避免了 PCR 擴增出現的錯誤率及偏好性 [1]。SMRT 的原理請見上一篇第三代定序 — SMRT 技術及原理，這篇來介紹奈米孔定序法（nanopore sequencing）。

和 SMRT 的優點相同，奈米孔定序法可以讀取長片段序列並且即時分析數據。Nanopore 技術的核心為插在薄膜上的跨膜蛋白，並在薄膜的兩端加上電位差，使溶液的離子通過跨膜蛋白形成電流。解旋酶（helicase）將待測的 DNA 帶到跨膜蛋白上，並解開DNA兩股，使其中單股 DNA 通過跨膜蛋白。此時通過奈米孔的 DNA 會對離子流動造成阻礙，使電流改變 [2]。因為不同鹼基會對電流改變產生不同影響，藉由量測大量已知序列造成的電流大小變化，可以用電流改變的模式來回推 DNA 的鹼基。其定序速度相當於 DNA 通過奈米孔洞的速度，約每秒 250 到 450 個鹼基。以其產品 MinION 為例，在 24 小時內能產生超過 5 Gb 的數據，且事前處理、製備建庫只需 10 分鐘 [3]。

Nanopore 也有許多缺點有待改善，例如當穿膜孔不通、孔洞破裂或多孔情況，皆會使電流的量測失準。另外，其使用電流大小變化來回推鹼基的粗錯誤率仍然相當高（一開始曾高達 30%，現在已降到 2-13%）。下方影片簡單介紹了他的原理。

值得一提的是，最近研究者發現 Nanopore 也能用來偵測表觀遺傳標記。他們使用稱做隱藏式馬可夫模型（hidden Markov models）的統計模型來計算鹼基序列，透過比較甲基化與一般的鹼基所產生的電流些微差異，可以檢測定序的鹼基是否有甲基化。不過目前的研究仍有幾個挑戰：第一、目前只能檢測 CpG 甲基化。第二、目前的訓練模型仍無法區分一段短序列（k-mers）中各自鹼基的甲基化情形，亦即他只能判斷這段序列是否全為甲基化／未甲基化 [4]。相信未來更多的研究與數據能逐漸克服這些難題。

目前，三代定序儀器逐步實現了穩定性、小型化，價格持續下降，分析軟體也不斷改進。Oxford nanopore 產品當中最受矚目的為 MinION，有著不到 100 克的重量，攜帶方便，有利於深入疫區的研究 [2]。在 2014 年非洲伊波拉病毒爆發時，需要在極短時間內了解病毒序列及診斷，MinION 就派上了用場 [5]。相信隨著準確度提升、通量不斷加大，技術會越來越成熟，應用領域也將不斷擴大，三代定序技術是未來的發展趨勢，實現大規模商業化將是大勢所趨。

參考文獻

Nanopore sequencing The application and advantages of long-read nanopore sequencing to structural variation analysis-nanoporetech(2017) https://ppt.cc/fcRfHx
Oxford Nanopore Technologies. (n.d.). Retrieved from https://nanoporetech.com/
Highlights of Clive G Brown’s Technical Update. (2018, January 5). Retrieved from https://nanoporetech.com/about-us/news/highlights-clive-g-browns-technical-update
Simpson, J. T., Workman, R. E., Zuzarte, P. C., David, M., Dursi, L. J., & Timp, W. (2017). Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing. Nature methods, 14(4), 407.
Hoenen, T., Groseth, A., Rosenke, K., Fischer, R. J., Hoenen, A., Judson, S. D., … & Wollenberg, K. R. (2016). Nanopore sequencing as a rapidly deployable Ebola outbreak tool. Emerging infectious diseases, 22(2), 331.