RNA定序的突破— RNA高度平行直接定序法

RNA 在細胞的功能不單是能轉譯成蛋白，細胞中的非編碼（non-coding）RNA 能夠調控細胞的轉錄、轉譯甚至有些具有酵素的特性，因此 RNA 研究領域逐漸被科學家重視。在DNA 定序發展快速的時代裡，RNA 定序的發展常受限於多種不同的限制，例如：RNA 分子穩定性、二級結構等影響。

一個好的 RNA 定序需要具備許多條件，包括：準確度、敏感度、專一性、偵測範圍廣、不需要模板、可以辨識修飾的核苷酸等條件。大部分已知的 RNA 定序法多需要利用反轉錄酶（reverse transcriptase）將 RNA 反轉錄成 cDNA 後再利用 PCR 將片段放大再定序，然而此方法可能伴隨鹼基錯誤，以及無法偵測到 RNA 修飾的結果。另外，FRT-seq（Flowcell Reverse Transcription sequencing）及 DRS™ 技術（Direct RNA Sequencing）雖然不需要經過 PCR 增幅片段，可避免 PCR 的缺點，卻無法用於檢測長片段 RNA 序列。因此 Oxford Nanopore Technologies 的 Daniel J Turner 團隊開發一種直接檢測核糖核酸的技術— RNA 高度平行直接定序法（highly parallel RNA direct sequencing）。

此技術利用奈米通道 （nanopore-based platform）讓單一 RNA 序列通過，其通道內設計了一個特殊的檢測蛋白可以辨識核苷酸並且產生電訊號。首先，需要解決的問題便是 RNA 片段必須要能夠帶到奈米通道上。故研究團隊設計出 poly-T 的 adaptor 可用於辨識 RNA 三端 poly-A 的序列，另外在尾端設計一個 motor enzyme 將 RNA 帶到奈米通道上。RNA 接上通道蛋白後，會被電壓推動進入通道內前進，並且被通道上的蛋白辨識核苷酸，完成檢測的工作。Daniel J Turner 團隊也指出可以透過設計不同的 adaptor 去辨識各種不同的核苷酸序列完成檢測。以此為基礎，我們可以在一個多通道的表面上同時檢測不同的 RNA 序列，將細胞的 RNA 表達量精確的檢測出來。

此 RNA 定序技術另一個特色則是可以辨識 RNA 核苷酸修飾。研究團隊將 m6A 和 5-mC 兩種常見的 RNA 修飾的電流圖放入系統內，可透過測量電流的變化，即可快速檢測出 RNA 修飾。

RNA 高度平行直接定序法仍有其限制和需要改善的地方，由於先前實驗資料都是建立於測量酵母菌的 RNA，因此許多參數修正都是趨近於酵母菌的 RNA。為了確認這種技術能夠測量其他物種的 RNA，之後會利用其它生物的 RNA 去建立電流數據，確認這樣的定序方式能夠準確檢測更多物種的 RNA 序列。另外，高昂費用和低精確度是這項技術的缺點，但是 Daniel J Turner 團隊相信這些問題在未來都能夠被逐一克服。此外，這個技術也需要克服 RNA 二級結構的問題，以及速率較低的問題。

總結以上的介紹，這項技術是目前唯一可以直接檢測 RNA 的序列，並且非常有效的檢測單一細胞各種 RNA 的表達量以及其修飾的定序方式。藉由這樣的技術，我們更能夠了解 RNA 在細胞內的變化及其影響。

參考資料：

1. Hussain, S. (2018). Native RNA-Sequencing Throws its Hat into the Transcriptomics Ring. Trends in Biochemical Sciences, 43(4), 225-227. doi:10.1016/j.tibs.2018.02.007

2.  Transcriptomics: identifying isoforms, splice variants and fusion transcripts. (2018, March 19). Retrieved from https://nanoporetech.com/transcriptomics
3.   Oxford Nanopore (@nanopore) on Twitter. (n.d.). Retrieved from https://twitter.com/nanopore
4.   Garalde, D. R., Snell, E. A., Jachimowicz, D., Sipos, B., Lloyd, J. H., Bruce, M., … Turner, D. J. (2018). Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods, 15(3), 201-206. doi:10.1038/nmeth.4577

撰文│林偉強
審稿│楊仁龍