第三代定序於臨床醫學上的應用

第三代定序相較於次世代定序（Next generation sequencing, NGS）的優勢不僅定序長度較長，還可以直接從最初的序列從頭定序（de novo sequencing），偵測出 DNA 或 RNA 的原始狀態。【三代定序再度掀起革命：從頭定序（de novo sequencing）】

目前用於臨床醫學研究的第三代定序平台主要為 Pacific Biosciences (PacBio)  的單分子即時定序（single molecule real time sequencing, SMRT）以及 Oxford Nanopore Technology (ONT) 的奈米孔定序法（nanopore sequencing），這兩個平台除了都有第三代定序的優勢之外，還有各自的特點，例如：PacBio 的高準確性以及 ONT 的便利性 [1]。

人類基因組不僅非常龐大，還非常複雜。由於 NGS 定序長度的限制，需要先打斷序列再進行 PCR 增幅（amplification）目標序列，尚無法克服過度重複 DNA 序列、極高或極低 GC 含量和高同源（homology）定序比較等問題。

以 X 染色體脆折症（Fragile X syndrome）為例，此疾病主要為 X 染色體上 FMR1 基因的 CGG 序列重複超過 200 次而造成。過度重複的序列導致基因不正常甲基化使 FMR1 蛋白質無法順利製造。如此過度重複和近乎 100% 的 GC 含量無法利用 NGS 來確認 CGG 序列的重次數目而診斷疾病的嚴重性。

2013 年，來自美國加利福尼亞大學醫學院的團隊便首次利用第三代定序－PacBio 的 SMRT 定序出高達 750 次重複且長達 2.25kb 的 CGG 序列，同時也發現重複序列會影響過程中聚合酶的連鎖反應且偏好從 CGG 和 CCG 重複片段配對 G  [2]。

另外，隨著精準醫療的發展，針對病患的基因背景和生活環境等衍生的個人化醫療逐漸盛行。人類基因體基本上有大約 99.9% 的一致性，僅有那 0.1% 決定個體之間的差異，因此序列存在著高度同源的區塊，在定序過程會造成假基因（pseudogenes）的出現而降低準確性。

這些高度同源的區域包含與主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex，MHC）有關的人類白血球抗原（human leukocyte antigen, HLA）基因。此類基因架構出免疫系統分辨自我與非自我分子的基礎，並且為人類基因密度最高且最具特異性的區域。

2017年，來自荷蘭馬斯垂克大學醫學中心的團隊便結合使用次世代定序 Illumina 的 MiSeq 和 Pacbio 的 SMRT 定序出完整的 HLA 序列並且發現了 1056 個新的等位基因（allele），為人類 HLA 基因序列的資料庫提供更完整且新穎的參考來源 [3]。

第三代定序的優勢增加了將此技術於臨床醫學的準確性和應用性，不過目前第三代定序多用於研究，若要實際用於診斷可能還需要考量其價格和後續相關患者採樣和演算平台的利用等等，但不可否認的是，第三代定序的出現為未來疾病診斷增加了新的選擇。

參考資料：

1. Ameur, A., Kloosterman, W. P., & Hestand, M. S. (2018). Single-Molecule Sequencing: Towards Clinical Applications. Trends Biotechnol. doi:10.1016/j.tibtech.2018.07.013
2. Loomis, E. W., Eid, J. S., Peluso, P., Yin, J., Hickey, L., Rank, D., . . . Hagerman, P. J. (2013). Sequencing the unsequenceable: expanded CGG-repeat alleles of the fragile X gene. Genome Res, 23(1), 121-128. doi:10.1101/gr.141705.112
3. Albrecht, V., Zweiniger, C., Surendranath, V., Lang, K., Schofl, G., Dahl, A., . . . Schmidt, A. H. (2017). Dual redundant sequencing strategy: Full-length gene characterisation of 1056 novel and confirmatory HLA alleles. HLA, 90(2), 79-87. doi:10.1111/tan.13057

撰文│黃子瑄
審稿│楊仁龍