從表觀遺傳學、發育學到神經科學：張毅的研究旅程

張毅老師從博士後研究嶄露頭角後，研究了許多表觀遺傳修飾相關酵素。近幾年來也解明了胚胎早期發育重要的機制，如今更轉向神經科學中上癮、學習與記憶的分子機制。就讓我們跟隨張毅老師的足跡，探索他從博士後研究員到近期幾年所做的研究吧！本篇之重點節錄以及張毅教授對學生的建議請見：【張毅教授專訪｜哈佛大學醫學院】。知識份子之前對張毅老師的訪問在此，有興趣的人也能透過那篇文章了解老師的研究。

 

博後的危機與轉機（1996-1999）

張毅在博士班時，主要研究核糖核酸酵素（ribozyme），亦即有酵素活性的 RNA（catalytic RNA）。在博士後研究之前，完全沒有接觸過蛋白質相關實驗，他心想：「如果要在學術圈走得長遠的話必須把該有的知識補起來。」因此在選擇博士後的實驗室時有意識地尋找生化實驗較強的實驗室。博士後研究就決定加入 Danny Reinberg 的實驗室，他的實驗室主要研究轉錄因子（ transcription factor），並且也是該領域的權威。技術上來說，張毅從來都沒有接觸蛋白相關的實驗，因此他也跟著博士班學生學習管柱（column）純化蛋白質等實驗。

當時教授提供了兩個課題，張毅選了比較困難的課題：比較細胞內基礎轉錄量（basal transcription）和被抑制因子 REST (RE1-silencing transcription factor) 抑制後的轉錄量。因為原本轉錄量就不高，因此很難觀察到轉錄因子被抑制的現象。因此，博後第一年完全沒有產出，由於和老闆討論更換研究主題無果，他決定開始規劃下一步實驗，同時也應徵生技公司的職位。

在一個偶然的情況下，他讀到西雅圖福瑞德哈金森癌症研究中心所發表在 Cell 的文章 [1]，並寫信向他們要到了文章中所使用的 sin3 抗體 。張毅試圖純化這個蛋白質複合體（protein complex）。當時已知 sin3 所屬的蛋白質複合體可以抑制基因表現，但具體的機制依然不清楚。他希望透過分析及純化蛋白質組成來了解這蛋白質複合體抑制基因的機制。

就在張毅找工作同時，蛋白質分析結果就出來了，他發現此複合體中居然帶有組蛋白去乙醯酶（histone deacetylase, HDAC）。 1996 年，科學家首度純化出 HDAC，並發現 HDAC 可抑制基因轉錄 [2]，而張毅也因此解釋了sin3蛋白質複合體抑制基因表現的原因。博後的第一篇 Cell 就這樣出來了 [3]。接著兩年，HDAC 複合體的各個次單位又陸續貢獻了五篇論文，更在 1998 年發現了 HDAC 複合體 NuRD 和其次單位 Mi2 負責染色質重組（Cell, 1998）。

這一連串的成功說是機緣使然嗎？最開始的 sin3 可能有機運的成分吧。不過若是張毅沒有勤於閱讀文獻，他或許也不會開始這個研究，更不會有後續的發現。如果沒有做好準備，就算機緣來了也抓不住，所謂天道酬勤莫過如此。

建立自己的實驗室

尋找組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase, HMT）

1999 年底，張毅離開了待了四年的實驗室，正式在北卡羅來納大學教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）建立起自己的實驗室。

當時有關組蛋白修飾僅知道組蛋白乙醯化（histone acetylation），其他修飾所知甚少。因此，張毅想投入到組蛋白甲基化的研究當中。要找到組蛋白甲基化修飾前，首要需要找到與甲基化相對應的酶，加以去除（knockout）並觀察變化。張毅透過博後研究時期所學會的蛋白質純化技術建立了一個快速檢測組蛋白修飾的方法，企圖尋找並測試組蛋白甲基化。不巧，2000 年 Thomas Jenuwein 的團隊率先發表相關論文（Nature, 2000），宣告他們發現了第一個組蛋白甲基轉移酶（H3 methyltransferase），負責甲基化 H3 上的賴胺酸（lysine）[4]。張毅的團隊那時雖然已經純化出組蛋白甲基轉移酶，但尚未測試其功能與甲基化位點，遺憾未能趕上成為第一個發現者。

編者注：2018 年的拉斯克獎（Lasker Award）頒給了 C. David Allis 和 Michael Grunstein 以表彰他們對於組蛋白研究的貢獻。

之後，張毅的團隊透過先前建立的分析方法讓他們在 2001 年發現了第一個作用於精胺酸（arginine）的組蛋白甲基轉移酶 PRMT1（Science, 2001）[5]，負責甲基化四號組蛋白的第三個精胺酸（H4R3）。同年，他也發現 H4K4 甲基轉移酶 SET7（Molecular Cell, 2001）[6]。在張毅當上 PI 的前四年裡，他總共發現了六種組蛋白甲基轉移酶 （PRMT1、ESET、SET7、SET8、PRC2、Dot1L），頗有囊括四海之勢，也奠定了他在表觀遺傳學的重要貢獻。

尋找組蛋白去甲基酶（histone demethylase）：三位博後的努力

2001 前後，張毅的重點轉向組蛋白去甲基化。所謂有陰就有陽，組蛋白的修飾有甲基化就應該有對應的去甲基化，這是再自然不過的想法。然而，張毅的團隊在尋找組蛋白去甲基化酶的過程可說是吃盡苦頭。一般蛋白質修飾相關的研究都是增加修飾比移除修飾簡單，例如加入某個蛋白質後使從原本沒有訊號的下游產物變成有訊號，這是比較好測量的；但移除某個蛋白質而使原本的訊號下降，就要確認降低的訊號是否為雜訊，有時移除效率差也看不出效果。在尋找組蛋白去甲基酶時，如何偵測離去的產物（release product）也是個大哉問，這也是為什麼這個題目一共經歷了三個博後的努力才找到該蛋白質。

要尋找一個從未被發現的酶是個格外困難的任務，當時甚至有科學家認為組蛋白去甲基化酶根本不存在。因此，張毅決定從基礎化學反應著手。2002 年的 Nature 文章中，發表了一個稱做 AlkB 的酶，利用亞鐵離子（Fe(II)）和 α-ketoglutarate 來移除受損 DNA 上的甲基，並在過程中產生甲醛（formaldehyde）[7]。張毅認為組蛋白的去甲基化可能也是遵循類似的反應，重點在於該如何準確的檢測出副產物甲醛呢？在檢測甲醛的過程從第一個博後做不出來，到第二個博後試圖用 TCA precipitation，但是仍功虧一簣。最後，第三個博後嘗試將甲醛轉換成比較容易偵測和分析的產物（ 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidine, DDL），再重新純化蛋白，才成功找到組蛋白去甲基酶（簡圖如下）。這個蛋白質主要是十文字（Jumonji C）家族，帶有共通的 JmjC 結構域（domain）。 （Nature, 2005; Nature, 2006; Cell, 2006）[8-10]。

尋找 DNA 去甲基化：真核生物的 DNA 甲基化是否可逆？

同一時間，張毅的實驗室也尋找著 5-mC 的去甲基化。和組蛋白去甲基化相同，一開始什麼都沒譜，同樣不知 cofactor 和 release product。拜大量閱讀所賜，張毅以化學角度解析 DNA 去甲基化，認為這個反應有點像已知的 thymidine salvage pathway：其中胸腺嘧啶（thymine）會經由兩個酶轉為鳥嘧啶（uracil）。首先透過胸腺嘧啶氧化酶（thymine hydroxylase）氧化其甲基→醇基（hydroxyl）→醛基（formyl）→羧基（carboxyl），再由去羧基酶去除其羧基（decarboxylation）（下圖）。這個生化反應在真菌與寄生蟲等低等生物裡都發現過，但高等生物還未被發現。張毅首先拿典型的 thymine hydroxylase 的序列去 blast，居然在人類基因上找不到這個酵素的homolog。然而，2007 年一篇在 Nucleic Acid Research 的文章報導了布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）裡的 base J binding protein 帶有 thymine hydroxylase 的功能 [11]。於是，張毅用這個新發現蛋白的序列去 blast。Bingo！他們找到了哺乳類的同源基因 TET (ten-eleven translocation gene)。

不過在 2009 年 Anjana Rao 的團隊搶先發表了這個蛋白，他們發現 TET 可以催化 5-mC → 5-hmC (5-hydroxymethylcytosine) 的反應（Cell cycle, 2009; Science, 2009），然而受限於分析工具，他們仍未摸清反應的全貌 [12,13]。另一方面，張毅的實驗室因為有明確的目的和理論，認為 TET 應該和 thymine hydroxylase 一樣，能夠氧化至醛基（5-fC）與羧基（5-caC）。他們很快地證實這一點，2011 年在 Science 發表了 TET 在 5-mc 上去甲基化的一系列反應，同時他們也預測了一個能去除羧基的酶 [14]。文章上線兩個月後，上海中國科學院發表了胸腺嘧啶DNA醣基化酶（thymine-DNA glycosylase, TDG）會移除整個 5-caC 鹼基，再由鹼基切除修復（base excision repair, BER）回覆成正常的胞嘧啶 [15]。

要梳理出整串反應並不容易，尤其是反應中的 5-caC 在一個細胞中只有約 900 個，相較之下，一個細胞大約有三十億對 DNA 鹼基，其難度不言而喻。其實細胞中的反應如果有千分之一或萬分之一的副產物，也是差不多的數量級。要證明這約莫 900 個 5-caC 是有意義的產物而非雜訊，靠得是去除下游的 TDG 後，上游的 5-caC 和 5-fC 會大量累積，而這也是實際上觀察到的現象 [16]。

其實從 2000 年開始張毅就有意尋找 DNA 的修飾。這十年中，他所獲得的知識與精準的實驗，讓他確信他們已將絕大部分的 DNA 修飾地毯式的搜索完畢。「後來也找不到其他的鹼基，或是就算有其數量也比 5-caC 低。」張毅說。

回顧這十幾年，張毅研究了各種 DNA 與組蛋白的修飾，包含組蛋白去乙醯化（HDAC complex）、組蛋白甲基化（如 PRC2）、組蛋白去甲基（JmjC 家族）、組蛋白泛素化（PRC1）、DNA去甲基化（Tet 家族），就只剩下組蛋白的磷酸化（histone phosphorylation）。這樣的研究對DNA修飾與表觀遺傳領域上有非常重大的貢獻，時至今日，大部分研究表觀遺傳以及DNA修飾的團隊依然依靠這些發現，進一步去探索在各個細胞的生理意義。

轉向：早期胚胎發育（early embryo development）

在表觀遺傳學領域大放光彩後，張毅將自己的研究轉向早期的胚胎發育，張毅認為這個領域仍然有非常有趣且還沒被解決的問題值得去探索。

早期胚胎發育過程

胚胎發育從精卵結合開始，途經多次的分裂形成約 32 個細胞的桑椹胚（morula），再形成囊胚（blastocyst），準備著床。在小鼠中，胚胎發育第 3.5 天（E3.5）特別有趣，此時囊胚中的內細胞群（inner cell mass, ICM）以及外部的滋胚層（trophectoderm）已經底定，且內細胞群中的細胞準備開始分化，踏向不同的命運。

精卵結合後，會發生一件有趣的事：卵子中的組蛋白（histone）會進入精子的 DNA 中取代其包裹的蛋白質。這是為什麼呢？因為一般細胞和卵子使用組蛋白來組裝 DNA，但精子為了將 DNA 壓縮到核中小小的空間，95% 的組蛋白被替換成一種特殊的蛋白質——精蛋白（protamine）。縱使精卵用來包裹 DNA 的蛋白質有如此大的不同，在四細胞期到桑椹胚時，來自雙親的染色質已幾無差異，只剩下小於 1% 的印痕基因（imprinting）有雙親的差別。精卵結合後劇烈的染色體重塑（chromatin remodeling）重新開啟了許多基因的表現，進而推動了胚胎早期發育。科學家正在努力闡明這些表觀遺傳標記／DNA／轉錄因子的動態 [17,18]。（下圖）。

精卵結合成合子（zygote）時，精子核膜會被分解，並形成新的原核（pronuclei）。一開始，精卵各自的原核不會合一，要在第一次分裂後形成二細胞期時，才會合成一個核 [18]。同時，一開始核內也沒有負責 DNA 去甲基的 TET 蛋白，也沒有負責 DNA 甲基化的 DNMT，因此隨著細胞分裂，DNA 的甲基化標記會逐漸被稀釋（replication-dependent dilution），直到著床後，才會重新建立甲基化標記 [19]。

如何研究胚胎發育的動態

小鼠的合子完全不會表達基因，但到了二細胞期（人類則為八細胞期），會啟動約 2000 個基因，這個重要的事件稱為合子基因體活化（zygotic genome activation, ZGA）[18]。最初因為單細胞合子不表達基因，沒有合適的 probe，所以很難研究這個過程。後來是用別的團隊開發的 DNase I hypersensitive site mapping 來分析能被 DNA 酶切割的DNA，通常對應到較能被轉錄的基因。不過這個技術一次需要幾百萬顆細胞才能定序，問題是要拿到那麼多胚胎可說是天方夜譚。張毅團隊只好改良此技術為只須約 100 顆細胞就能分析的 low-input DNase-seq (liDNase-seq)，這才得以研究胚胎早期的染色質可近性（chromatin accessibility／DNase I hypersensitivity regions, DHRs) ，並從中找到轉錄因子 NFYA，和 ZGA 中 300 多個基因有關（Cell, 2016）[20]。【脫離母親之二三事 —— 談細胞週期】

體細胞核轉移胚胎的動態與門檻

以桃莉羊聞名的體細胞核轉移（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技術，雖然能夠複製動物，但其效率非常低，當初桃莉羊是 277 個胚胎中唯一成功的。拿小鼠來說，若使用體外受精（in vitro fertilization, IVF）等人工生殖技術，約有五六成的胚胎能成功出生，然而使用 SCNT 其比率只有 1% 左右 [21]。

張毅說：「這是因為體細胞有它本身的表觀遺傳記憶，雖然胚胎發育早期的機制能協助清除許多標記，但仍有些標記難以清除。但 SCNT 還是有某些胚胎能長大，那是因為某些酶在隨機碰撞中開啟了對發育重要的基因。」

這表示，在 SCNT 中仍然有許多待跨越的障礙，其中之一是 H3K9me3 抑制性標記。他們團隊近年發現，體細胞核在分化過程中加上的 H3K9me3 會妨礙 SCNT 胚胎的重編程（reprogramming）。為了改善 SCNT成功率，他們在胚胎中注入了組蛋白去甲基酶 Kdm4d 的 mRNA，以去除 H3K9me3 標記，讓原本約 1% 的胚胎出生率頓時上升至 10%，雖未達到 IVF 的比率，但已是相當大的進步（Cell, 2014）[21]。

隔年，他們也將此技術用在人類胚胎，改善了 ZGA 的效率，並對核轉移之胚胎幹細胞（NT-ESC）於再生醫學的應用提供了一個方向（Cell Stell Cell, 2015）[22]。2018 年初首度發表的複製猴（中中、華華）就是中國的科學家以相同方法處理獼猴（Macaca fascicularis）的 SCNT 胚胎所做出來的 [23,24]。在此之前，複製靈長類總是因為胚胎重編程的門檻過高而無疾而終。

2017 年，張毅團隊發現有別於 DNA 甲基化，新的基因印痕機制——組蛋白甲基化的差異（H3K27me）（Nature, 2017）[25]，同年也發現和 X 染色體去活化相關的 Xist 的印痕也是用同樣的機制（Genes & Development, 2017）[26]。 此基因印痕的機制同樣也構成了 SCNT 的門檻之一（Cell Stem Cell, 2018) [27]。

張毅實驗室用各種高精密度的技術來研究胚胎早期發育，有橫掃千軍之勢。現在單細胞定序等技術業已成熟，加上各實驗室的努力，「我預計胚胎發育、細胞命運決定（cell fate determination）大概五年內可以被解決得差不多。」張毅言談中透露著自信，而這自信乃是奠基於他一絲不苟的個性。

踏進神經學機制：記憶、獎賞與成癮（reward & addiction）

張毅過去 20 年約每五年換一個新主題。把表觀遺傳標記做完之後，開始做早期胚胎發育，包含 ZGA、幹細胞分化（stem cell lineage commitment）、基因印痕和 SCNT 等。

下一步要做什麼？張毅肘度。他一直對腦與神經很有興趣。「我認為要完全了解大腦是不可能的，就像你無法把自己舉起來一樣。因為我們是用自己的大腦思考，去了解自己的大腦。」秉持著這股好奇心，張毅踏入了這個對他而言全新的領域。

研究獎賞與成癮的動機有三。第一、張毅想了解「記憶」的機制，而藥物成癮必須基於對該藥物的記憶，沒有記憶就不會成癮。第二、可以解決實際問題：在美國，鴉片類藥物氾濫（opioid epidemic）是個重要的課題。他認為，疼痛或許和成癮也有關係，不然不會很多止痛藥都會成癮。第三、在細胞發育中有所謂的「表觀遺傳記憶（epigenetic memory）」，那麼由神經元連結所構成的記憶是否有其表觀遺傳學的基礎（epigenetics of memory）呢？

一開始踏入不熟的領域，就是要從念書開始，這對他絕非難事。他了解到大腦中的獎賞迴路（reward circuitry）和腹側被蓋區（ventral tegmental area, VTA）中的多巴胺神經元（dopamine neuron, DA）、伏隔核（nucleus accumbens, NAc）、前額葉（prefrontal cortex, PFC）與下視丘（hypothalamus）都有關係。

他認為目前的研究有兩個問題：第一、沒有良好的小鼠藥物自我施打模型（self-administration model）。許多實驗者負責施打藥物的研究中，充其量是測試藥物效果，並不適合用來研究成癮。所謂的成癮，是要即使有負面效果（如電擊），小鼠也要渴望給自己打藥的。因此張毅的實驗室訓練了一批會給自己打古柯鹼的老鼠（intravenous cocaine self-administration in mice）。第二、缺乏細胞異質性（cell heterogeneity）的研究，以往多是以細胞型態或功能來區分不同的細胞，但這些分類或許過於粗略，亦即許多神經元的分類底下還能再加以細分。因此他打算先將不同腦區中的神經元加以分類，找出不同的神經元群體（cell cluster）和其投射的區域等，同時從分子機制與細胞間的互動來解析大腦。目前他們已將下視丘的細胞以轉錄體（transcriptome）加以分類 [28]。

「這個問題大概可以做到我退休。」張毅坦承。這是段看不見盡頭的路，不過以他踏實的腳步，路上美妙的風景也會逐漸浮現。

參考資料

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訪問｜紀威佑、林偉強
撰稿｜紀威佑、林偉強
審稿｜張毅、陳恩浩、紀威佑、林偉強
封面｜黃云宣