對單一細胞的深度解析：單一細胞分析發展與限制

在以往研究疾病治療方法時，雖然挑選特定種類的細胞株作為研究平台，但仍會面臨細胞之間有「異質性」（heterogeneity）的問題，在癌症的研究中發現細胞的異質性也是影響腫瘤生長的重要因子之一。然而，這些微妙的差異干擾，導致無法準確地分析疾病模式。因此，若能從單一細胞分析的層次切入，應該更有助於發掘利用細胞群時所無法辨明的機制。本篇文章將針對現今單一細胞分析法中的三大主要領域：基因體、轉錄體、蛋白質體進行介紹。

為了進行單一細胞基因體分析，須先將基因體擴增後定序，擴增可透過 polymerase chain reaction（PCR）進行；然而，非線性的擴增方式會造成某些基因被隨機地過度擴增，造成分析時的偏誤。藉由多次黏合環狀擴增技術（multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC）透過互補序列使擴增出的片段黏合成環狀，避免其繼續成為 PCR 的模板，減少基因體的擴增時的偏誤，此技術可更準確地分析單一細胞中基因拷貝數變異（copy number variation, CNV）及單核苷酸變異（single-nucleotide variation, SNV）[1]。

在單一細胞轉錄體分析領域中，幾乎每個月都會有更加深入且大量的分析方式被發表，透過微流體技術的結合，可節省分析時間並減少汙染的影響。CytoSeq 及 inDrop 是兩種近期最受歡迎的單一細胞轉錄體的分析方法，前者是將細胞稀釋後，使每個細胞分布於不同的微孔中，微孔中有特殊設計帶有引子的珠子，藉由這些引子進行轉錄體分析 [2]，inDrop 則是將單一細胞注入含有裂解緩衝液的微滴中，再進行反轉錄分析 [3]。為了使反轉錄的 cDNA 量能更準確代表真正 mRNA 的量，則會設計一段 Unique Molecular Index（UMIs）作為辨識不同 mRNA 的條碼，藉此有效地減少定量上的偏誤 [4]。

不同於傳統的蛋白質體可利用質譜儀分析，單一細胞蛋白質體的分析往往需先仰賴抗體的辨認，因此無法作為發現新蛋白質的工具。質譜流式細胞技術（mass cytometry）是目前最成熟的分析單一細胞蛋白質體工具，由含有過渡金屬標記的抗體結合蛋白質後，藉此回推單一細胞中的特定蛋白質組成及比例 [5]。此外，利用微流體平台發展的 microengraving、單一細胞條碼晶片（single-cell barcode chips, SCBCs）及單一細胞西方墨點法（single-cell Westerns）[6] 等都提供了更多分析單一細胞蛋白質體的選擇。

單一細胞分析技術是近年來的熱門研究，也因此探索了很多以往無法得知的問題，像是在癌症的研究上，可協助釐清循環腫瘤細胞（cyclic tumor cells, CTCs）的起源 [7]，或是探索細胞間變異性所造成的機制，甚至更深入分析藥物對於特定單一細胞的影響。然而，至今多數的單一細胞分析技術都還停留在學術實驗階段。此外，對於單一細胞深度分析的演算法更加不成熟，如何解讀大量的資料仍是一大挑戰，但隨著技術不斷地更新，相信單一細胞分析技術會為生物學的研究帶來新的變革。

參考資料：

1. Heath, J. R., Ribas, A., & Mischel, P. S. (2015). Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery, 15(3), 204-216. doi:10.1038/nrd.2015.16
2. Zong, C. (2012). Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science, 338(6114), 1622-1626. doi:10.1126/science.1229164
3. Fan, (2015). Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science, 347(6222), 1258367-1258367. doi:10.1126/science.1258367    
4. Klein, A. (2015). Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell, 161(5), 1187-1201. doi:10.1016/j.cell.2015.04.044
5. Spitzer, M., & Nolan, G. (2016). Mass Cytometry: Single Cells, Many Features. Cell, 165(4), 780-791. doi:10.1016/j.cell.2016.04.019
6. Quadri, S. M. (2015). Single-Cell Western Blotting. Methods in Molecular Biology, 455-464. doi:10.1007/978-1-4939-2694-7_46
7. Ni, X., Zhuo, et al.(2014). Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Cancer Research, 74(19 Supplement), 3577-3577. doi:10.1158/1538-7445.am2014-3577

撰文│熊浩安
審稿│吳畇芸