待解的謎題
RNA的表觀遺傳學 (RNA epigenetics) 或稱表觀轉錄組學 (epitranscriptomics) 是近十年逐漸興起的領域，主要探討 RNA 的修飾與相關的生理機制作用。許多種類型的 RNA 修飾可發生在體內各種類的 RNA 上，包含 mRNA、rRNA、tRNA、snRNA 等。其中最為常見而廣為人知的，便是發生在 RNA 的 m6A (N6-methyladenosine) 上的甲基化修飾作用，過去的研究發現 m6A 參與了轉錄作用的 RNA splicing、影響 RNA 穩定性等功能；近幾年許多重大的研究成果都在探討與 m6A 修飾相關的酵素與相關機制。
在參與 RNA 修飾的相關因子中，FTO (Fat mass and obesity-associated protein) 這個基因最初被發現與肥胖相關，但科學家一直不清楚其主要機制，直到最近才發現他是一種負責修飾 RNA 的去甲基化酶。RNA 修飾是表觀遺傳學的研究重點，但對於 FTO 在 RNA 修飾作用所扮演的角色，及其作用受質在近年不同的研究成果中仍眾說紛紜。
圖片說明：m6A 修飾之可能機制與關聯的生理作用；圖片來源：RNA N6-methyladenosine modification in cancers: current status and perspectives. Cell Research, (2018). doi:10.1038/s41422-018-0034-6
圖片說明：與 m6A 相關的多種生理功能；
圖片來源：Dynamic transcriptomic m6A decoration: writers, erasers, readers and functions in RNA metabolism. Cell Research, (2018). doi:10.1038/s41422-018-0040-8
研究主軸
康乃爾大學 Samie Jaffrey 的團隊於 2017 年的發表的論文認為 FTO 傾向對 RNA 中的 m6Am (N6, 2-O-dimethyladenosine) 而非 m6A 進行去甲基化的作用，而此作用會進而降低 m6Am mRNA 的穩定性 [1]。今年二月份，於 Nature Chemical Biology 期刊上發表的研究再度指出，FTO 調控了小核 RNA (small nuclear RNA, snRNA) 中 m6Am 的可逆性甲基化 [2]。
圖片說明：m6A 與 m6Am 之結構差異；圖片來源：Molecular Neurobiology, (2018). doi:10.1007/s12035-018-1138-1
研究背景
snRNA 為真核生物中為數最多的一類非編碼 RNA (non-coding RNA)，具有高含量的尿嘧啶 (U)，因而以之命名為 U1、U2 等。其功能與 RNA 剪切 (RNA splicing) 有關，參與 pre-mRNA 剪接成 mRNA 之過程。
snRNA 依照序列特性和關聯蛋白質分成兩類，一類是 Sm-class snRNA，由 RNA polymerase II 負責轉錄（主要包含 U1、U2、U4、U4atac、U5 等）；另一類是 Lsm-class snRNA，由 RNA polymerase III 負責轉錄（主要包含 U6 和 U6atac）。Sm-snRNA 被轉錄出來後，會形成如同 mRNA 的 N7-methylguanosine (m7G) cap 的結構，作為一個向細胞核外傳輸的訊號，協助自身前往細胞質中加工修飾，並接著與 Sm 蛋白質結合，最終與其他蛋白組合成「小核核醣核蛋白」(small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs)。這個過程中，原先的 m7G cap 會被甲基化形成 N2,2,7-trimethylguanosine (TMG) cap，snRNA 的 3’ 端則被切除。最後 snRNPs 會再被送回到細胞核中，組合成剪切體 (spliceosomes) 協助 pre-mRNA 的剪切。而 Lsm snRNAs 則只會待在細胞核中透過外部特殊的啟動子與 RNA polymerase III 進行轉錄。
圖片說明：Spliceosomal splicing cycle；
圖片來源：JBrain. (2007). Splicéosome [CC-by-sa-2.0]. Retrieved from https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/30/Spliceosome_ball_cycle_new2.jpg
研究成果
Samie R. Jaffrey 教授團隊發現 snRNAs 的生合成與一個可逆的甲基化修飾調控有關，並依照甲基化特性的不同將 snRNAs 分為 m1 isoform（帶有單甲基化的 Am） 和 m2 isoform（帶有雙甲基化的 m6Am），各自對剪接有不同的影響。他們認為 m2-snRNA 為 FTO 主要的結合目標，在生成早期將 m2 轉變回 m1 isoform。
圖片說明：m7G、Am 與 m6Ａm 之結構；圖片來源：J Mauer et al. Nature (2016) doi:10.1038/nature21022
研究團隊在抑制 FTO 表現後，透過 miCLIP 技術〔註〕分析轉錄體中包含 m6A 和 m6Am 的 RNA，發現 Sm-snRNA 的變化最為顯著。進一步的分析更發現缺乏 FTO 將會造成剪接體中 Sm-snRNA 的轉錄起始核苷酸 (transcription-start nucleotide) 甲基化增加。此外，研究團隊也以免疫墨點法比較正常和 FTO 缺乏的細胞，發現缺乏 FTO 會使成熟的 snRNAs 甲基化增加。在薄層層析 (thin-layer chromatography, TLC) 的結果中亦顯示，缺乏 FTO 的情況下 m6Am 的上升比 m6A 更為明顯，說明 FTO 主要影響 snRNA 上 m6Am 的去甲基化。而 Lsm-snRNA 則因轉錄起始核苷酸不具有腺嘌呤 (A)，因而也不具有 m6Am，是以 FTO 缺乏並不影響該處甲基化程度。但他們認為，因 Lsm-snRNA 也會與 Sm-snRNA 一同組成幾個 snRNPs，FTO 缺乏仍可能間接的帶來影響。
圖片說明：Spilcesomal snRNPs 的組成與 snRNA 的二級結構；圖片來源：Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harb Perspect Bio, (2011). doi:10.1101/cshperspect.a003707
- 註：miCLIP (m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation)，為一種分析 RNA 修飾的技術 [3]。
圖片說明：miCLIP 操作流程；
圖片來源：Linder, B., Grozhik, A. V., Olarerin-George, A. O., Meydan, C., Mason, C. E., & Jaffrey, S. R. (2015). Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods, 12(8), 767-772. doi:10.1038/nmeth.3453
圖片說明：用於檢測 m6A 的表觀轉錄組定序技術 (Epitranscriptomic sequencing)；
圖片來源：Suminwei (2017). Methods developed to profile m6A [CC-by-sa-4.0]. Retrieved from https://commons.wikimedia.org/wiki/File:M6A_methods.png
FTO 影響 snRNAs 的 m6Am 甲基化修飾，但有何重要性呢？
在過往的研究中，科學家對於 FTO 參與的 RNA 甲基化修飾之作用受質與機制仍抱持著不同的意見；此篇研究則是轉以 snRNA 為研究目標，為 FTO 參與的可逆甲基化修飾之機制提出了一種新的解釋。然而，關於 FTO 所影響的 snRNA 的 m6Am 甲基化修飾是如何影響其他生理功能，以及 FTO 在其他 RNA 的作用受質與調控機制是否也可能共同參與生理反應調控，都是很值得深入探究的議題，期待未來更多的證據能進一步解決這項謎題。
圖片說明：圖中顯示 mRNA 與 snRNA 的5’ cap 結構［註］。圖片來源：New roles for old RNA cap flavors. Nature Chemical Biology, (2019). doi:10.1038/s41589-019-0252-3
- 註：snRNA 的結構中，圖左側連接的鳥苷 (G) 具有三個甲基，會再進一步形成如 mRNA 左側結構的 m7G cap；而本篇研究重點則在於 FTO 可去除 m6Am cap 上的一個甲基 (圖中圈選處之 N6-methyl group)，使之轉變為 Am cap，進而調控外顯子的保留。
參考文獻：
- Mauer, J., Luo, X., Blanjoie, A., Jiao, X., Grozhik, A. V., Patil, D. P., … Jaffrey, S. R. (2016). Reversible methylation of m6Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature, 541(7637), 371–375. doi:10.1038/nature21022
- Mauer, J., Sindelar, M., Despic, V., Guez, T., Hawley, B. R., Vasseur, J., … Jaffrey, S. R. (2019). FTO controls reversible m6Am RNA methylation during snRNA biogenesis. Nature Chemical Biology, 15(4), 340-347. doi:10.1038/s41589-019-0231-8
- Linder, B., Grozhik, A. V., Olarerin-George, A. O., Meydan, C., Mason, C. E., & Jaffrey, S. R. (2015). Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods, 12(8), 767-772. doi:10.1038/nmeth.3453
撰文｜高唯真、藍冠鈞
審稿｜紀威佑、藍冠鈞
