為了精確調控細胞運作，生物工程學家試圖發展多種系統，以接收外界訊號刺激及產生相對的反應（生成產物），蛋白質、RNA、脂質、輔酶都可以當作這些系統的開關。目前為止，RNA調控系統（RNA switch, RNA sensor）較蛋白質調控系統容易模組化，替換基因元件時亦較具有獨立性。在過去科學家的設計中，RNA 調控系統皆直接連結至最終表現的蛋白質（protein actuator），開啟接下來的反應，如酵素活性、製造特定分子，為兩階段的控制結構。然而，因為 RNA switch 與 protein actuator 之間的動態範圍（dynamic range）需相符，這使的 RNA 與蛋白質的配對選擇變少。史丹佛大學的王彥襄及其研究團隊，建構了三階段調控系統，在 RNA switch 與 protein actuator 之間，加入一個放大系統（amplifier），使動態範圍的對應更容易，並增強訊號放大的效果。
首先，RNA switch 是一個可以跟訊號分子結合的 RNA，結合訊號分子之後，這段 RNA 便不容易被分解。放大系統位於 RNA switch 的前段，為一段由 DNA 結合區域（BD, DNA-binding domain）與活化區域（AD, activation domain）兩部分構成的轉錄因子，兩個區域之間使用多肽鏈連接，如此一來能任意替換兩種 domains。放大系統後續將啟動下游目標基因，製造 protein actuator，發揮特定功能。
圖一：本研究的基因控制系統設計。AD，指轉錄因子的 activation domain； BD，指轉錄因子的 DNA-binding domain；RS：RNA switch；EN：epigenetic enhancer；OP：operator site；GOI：gene of interest，原始論文稱 protein actuator。圖片來源：https://goo.gl/rieoHU
研究團隊將一整組三階段調控系統表現於酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）之中，並進行一連串電腦模擬與實驗證明此設計的可行性：藉由表現強效的轉錄因子與弱效的啟動子，達最高的表現擴增比率；更找出增強子（enhancer）與啟動子（promoter）之間的最佳距離為 160 鹼基對，藉此再提高 6 倍的表現效率。
為了找到適當的動態範圍，他們使用能與茶鹼（theophylline）結合的 THEO1 RNA switch、結合細菌與病毒轉錄因子的放大系統與加強型綠色螢光蛋白（EGFP, enhanced green fluorescent protein）當作最終表現的蛋白質。在實驗中，研究者搭配不同強度的啟動子，找到最適合的啟動子為 STE5，證明啟動子的強弱程度為控制動態範圍的關鍵。研究團隊也替換了不同種類的 RNA switch，含 TC2、NEO2、FA11，分別接受四環黴素、新黴素、醛葉酸作為外來訊號，這些組合都有相當好的表現效果，證明了整體設計的模組性（modularity）相當棒。
當基本的設計可行，科學們便進而去除轉錄因子的 activation domain，只保留 binding domain，這樣便會阻止 protein actuator 表現，藉此設計成抑制型調控系統。除了建立抑制型調控系統，研究團隊更建立布林邏輯運算器：若將兩個 RNA switches 串聯，這使得調控系統需同時接受 2 種訊號分子，才會表現 protein actuator，在整體調控流程就如同布林邏輯的 「AND」；同理，若設計兩個獨立的 RNA switches，但串聯兩個操縱子，將讓調控系統任接受 1 種訊號分子，即可表現 protein actuator，如同 「OR」；如果設計兩個獨立的 「AND」 switches，搭配串聯的兩個操縱子，可組成 「SoP, sum-of-product 」的調控機構。經實驗證明，以上的設計都得以正確的調控 protein actuator 基因為開或關，但是如果引入越多個 RNA switches，基因處於關閉狀態的表現量會越來越高，所以開啟狀態的表現量增幅會減少。
圖二：布林邏輯調控的設計。圖片來源：https://goo.gl/rieoHU
研究團隊設計了一個全新的 RNA-蛋白質調控系統，應用 RNA 作為訊號受體，控制下游的基因表現，不論是增強、抑制皆可達成，還能擴增為布林邏輯調控模式，也設計出了正負回饋系統（詳見原始論文）。本研究為合成生物學帶來調控手段的各種可能性，只要調控外加的化學訊號，便可讓細胞如同電腦般運算，準確的影響多個基因表現。
註：此處的動態範圍意指生物訊號的輸入，與系統輸出的對應關係，例如輸入1至10，會得到20至100的輸出。
參考資料：
- Wang, Y., McKeague, M., Hsu, T. M., & Smolke, C. D. (2016). Design and Construction of Generalizable RNA-Protein Hybrid Controllers by Level-Matched Genetic Signal Amplification. Cell Systems, 3(6), 549-562.e7. doi:10.1016/j.cels.2016.10.008
撰文 │ 王振宇
