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用RNA控制基因開開關關

為了精確調控細胞運作,生物工程學家試圖發展多種系統,以接收外界訊號刺激及產生相對的反應(生成產物),蛋白質、RNA、脂質、輔酶都可以當作這些系統的開關。目前為止,RNA調控系統(RNA switch, RNA sensor)較蛋白質調控系統容易模組化,替換基因元件時亦較具有獨立性。在過去科學家的設計中,RNA 調控系統皆直接連結至最終表現的蛋白質(protein actuator),開啟接下來的反應,如酵素活性、製造特定分子,為兩階段的控制結構。然而,因為 RNA switch 與 protein actuator 之間的動態範圍(dynamic range)需相符,這使的 RNA 與蛋白質的配對選擇變少。史丹佛大學的王彥襄及其研究團隊,建構了三階段調控系統,在 RNA switch 與 protein actuator 之間,加入一個放大系統(amplifier),使動態範圍的對應更容易,並增強訊號放大的效果。

首先,RNA switch 是一個可以跟訊號分子結合的 RNA,結合訊號分子之後,這段 RNA 便不容易被分解。放大系統位於 RNA switch 的前段,為一段由 DNA 結合區域(BD, DNA-binding domain)與活化區域(AD, activation domain)兩部分構成的轉錄因子,兩個區域之間使用多肽鏈連接,如此一來能任意替換兩種 domains。放大系統後續將啟動下游目標基因,製造 protein actuator,發揮特定功能。

圖一:本研究的基因控制系統設計。AD,指轉錄因子的 activation domain; BD,指轉錄因子的 DNA-binding domain;RS:RNA switch;EN:epigenetic enhancer;OP:operator site;GOI:gene of interest,原始論文稱 protein actuator。圖片來源:https://goo.gl/rieoHU

研究團隊將一整組三階段調控系統表現於酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之中,並進行一連串電腦模擬與實驗證明此設計的可行性:藉由表現強效的轉錄因子與弱效的啟動子,達最高的表現擴增比率;更找出增強子(enhancer)與啟動子(promoter)之間的最佳距離為 160 鹼基對,藉此再提高 6 倍的表現效率。

為了找到適當的動態範圍,他們使用能與茶鹼(theophylline)結合的 THEO1 RNA switch、結合細菌與病毒轉錄因子的放大系統與加強型綠色螢光蛋白(EGFP, enhanced green fluorescent protein)當作最終表現的蛋白質。在實驗中,研究者搭配不同強度的啟動子,找到最適合的啟動子為 STE5,證明啟動子的強弱程度為控制動態範圍的關鍵。研究團隊也替換了不同種類的 RNA switch,含 TC2、NEO2、FA11,分別接受四環黴素、新黴素、醛葉酸作為外來訊號,這些組合都有相當好的表現效果,證明了整體設計的模組性(modularity)相當棒。

當基本的設計可行,科學們便進而去除轉錄因子的 activation domain,只保留 binding domain,這樣便會阻止 protein actuator 表現,藉此設計成抑制型調控系統。除了建立抑制型調控系統,研究團隊更建立布林邏輯運算器:若將兩個 RNA switches 串聯,這使得調控系統需同時接受 2 種訊號分子,才會表現 protein actuator,在整體調控流程就如同布林邏輯的 「AND」;同理,若設計兩個獨立的 RNA switches,但串聯兩個操縱子,將讓調控系統任接受 1 種訊號分子,即可表現 protein actuator,如同 「OR」;如果設計兩個獨立的 「AND」 switches,搭配串聯的兩個操縱子,可組成 「SoP, sum-of-product 」的調控機構。經實驗證明,以上的設計都得以正確的調控 protein actuator 基因為開或關,但是如果引入越多個 RNA switches,基因處於關閉狀態的表現量會越來越高,所以開啟狀態的表現量增幅會減少。

 

圖二:布林邏輯調控的設計。圖片來源:https://goo.gl/rieoHU

研究團隊設計了一個全新的 RNA-蛋白質調控系統,應用 RNA 作為訊號受體,控制下游的基因表現,不論是增強、抑制皆可達成,還能擴增為布林邏輯調控模式,也設計出了正負回饋系統(詳見原始論文)。本研究為合成生物學帶來調控手段的各種可能性,只要調控外加的化學訊號,便可讓細胞如同電腦般運算,準確的影響多個基因表現。

註:此處的動態範圍意指生物訊號的輸入,與系統輸出的對應關係,例如輸入1至10,會得到20至100的輸出。

參考資料:

  1. Wang, Y., McKeague, M., Hsu, T. M., & Smolke, C. D. (2016). Design and Construction of Generalizable RNA-Protein Hybrid Controllers by Level-Matched Genetic Signal Amplification. Cell Systems, 3(6), 549-562.e7. doi:10.1016/j.cels.2016.10.008

撰文 │ 王振宇

修訂 │ 劉馨香

About the author

王振宇

王振宇

臺大學生,醫學雙主修生科,一邊在醫院當路障一邊在實驗室學習,還時常妄想跑到野外觀察植物。專長為植物分類學及演化,先前在臺師大生科系種子植物分類學研究室,研究台灣紫背草屬植物的分類及雜交,目前正在轉換到臺大臨床醫學研究所,執行科技部大專生計畫,研究台灣淡水魚類的雜交及演化。其他的興趣還包含民俗植物與新藥開發、攝影、結構生物學與演化。希望能在Investigator多多寫文章推廣科學新進展。