工具箱升級！ — Blue-OFF 雙重光調控系統

      在基因轉錄的層面上，以化學物質誘導或抑制某個基因表現的方法已經非常廣泛地被應用於實驗室中，通常是透過藥物結合到轉錄因子 (Transcription factors)，改變其構型並影響其與 DNA 之間的親和力與交互作用，在此我們將其稱為基因表現的 「化學開關 (Chemical-based switches)」。此種方法在操作面上也有限制和缺點，例如：難以避免的毒性或者是脫靶效應 (Off-target effect) ，想停止這項調控時卻無法完全進行逆轉。而「光調控開關 (Optogenetic switches)」恰巧能克服上述的難題 ，藉著調整光譜、照射的區域和時間，可以達到精準調控基因表現與動物行為，例如以藍光照射腦部特定區域讓小鼠表現繞圈行走的行為 [2]。由於光調控的精準與便利性也使這項技術在發展生物學及神經生物學領域發光發熱，同時也在 2010 年被 Nature 期刊選為 「Method of the year」[2]。不過目前為止發展出的光調控系統大多為誘導基因表現 (Induction)，較少用來抑制 (Repression) 而且現有系統的效率較低 [3]，因此本篇論文的目的便是希望能將光調控開關同時應用在 DNA 轉錄及轉譯後 (Post-translation) 蛋白穩定度的階段，進而達到較高的抑制蛋白表現效率。

       本研究中 Blue-OFF 系統的雙重光調控 (dual-controlled optogenetic system) 包含兩組光反應蛋白模組 (light-responsive protein module)，分別調控基因轉錄與蛋白降解的部分 (Figure 1a)，共同點是皆含有感測域 (light–oxygen–voltage-sensing domain，LOV domain)。感測域中的半胱胺酸 (Cysteine) 與吸收特定波長藍光的能量後的黃素單核苷酸 ( Flavin mononucleotide，FMN ) 形成鍵結，成為發色基團 (Chromophore) 之外更能後續誘發蛋白的構型變化以發揮功能。其一的 KRAB-EL222，能在光照後發揮轉錄抑制子 (Repressor) 的功能 (Figure 2) [3]。B-LID 作為降解決定子 (Degron)，則是因為插入一段胺基酸序列 「RRRG」之中，能在光時會暴露出來活化蛋白酶體 ( Proteasome )，降解接上 B-LID 的蛋白。[4]

       這兩個光反應蛋白模組獨立存在時，可以分別抑制了 50% 與 54% 的 FLuc ( Firefly luciferase ) 表現，而合併二個模組成為 Blue-OFF 時則可抑制 91% ，顯示光調控的模組效果加成 (Figure 1b)。作者更進一步驗證了光調控模組在操控基因表現時機上的便利性與可逆性 (Reversibility)，在照射 12 小時的藍光後，蛋白質表現量可降低至約初始的 10%，接著待在黑暗環境下 12 小時便可偵測到蛋白質表現量回升。同時，作者告訴了我們 Blue-OFF 於多種哺乳類細胞中都是可行的，研究團隊測試了人類、倉鼠及猴子的細胞，都有不錯的效果 (Figure 3)。除了應用合成生物學的模組概念，發揮創意開發了 Blue-OFF 系統，作者也將光照時間、強度以及蛋白質表現量整合成可用來預測的定量性 (Quantiative) 數學模型，讓調控系統可以更精準，也把這個系統應用於活化凋亡蛋白酶 (Caspase 8)，操控細胞凋亡的實驗中。

本篇論文啟發了光遺傳學技術在透過不同模組的排列與組合，還能有更廣泛、更全面的應用，或許讀者們下次也能親自動手嘗試看看將光調控應用在自己的實驗上，說不定未來某一天你也可以開發出自己獨特的光調控系統喔！

 

參考文獻：

1. Baaske, J.,Gonschorek, P., Engesser, R., Dominguezm M. A., Raute, K., Fishchbach, P., Muller, K., Cachat, E., Schamel, WWA., Minguet, S., Davies, JA., Timmer, J., Weber, W., Zurbriggen. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci. Rep. 8, Article number:15024 (2018)
2. Method of the Year：Optogenetics by Nature Video https://www.youtube.com/watch?v=I64X7vHSHOE&t=19s
3. Bonger, K. M., Rakhit, R., Payumo, A. Y., Chen, J. K. & Wandless, T. J. General method for regulating protein stability with light. ACS Chem. Biol. 9, 111–115 (2014).
4. Nash, A. I. et al. Structural basis of photosensitivity in a bacterial light-oxygen-voltage/helix-turn-helix (LOV-HTH) DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 9449–9454 (2011).

撰文｜姚京含
審稿｜陳帝亢