糖尿病 (Diabetes) 影響全球 4.2 億人。許多糖尿病症狀是血管變化的結果，血管變化導致血液循環障礙和組織供氧不足。儘管流行病學上常見，但對糖尿病引起的血管病變 (vasculopathy) 仍所知甚少。近期發表於 Nature 期刊，由奧地利科學院分子生物技術研究所 (IMBA) Josef Penninger 帶領的研究團隊利用人類多功能幹細胞 (human pluripotent stem cells; hPSCs) 培養出血管類器官並成功模擬出糖尿病血管病變 [1]，並進一步找出藥物的標靶，這個突破將改變治療糖尿病的遊戲規則。
圖一：用於模擬糖尿病血管病變的人類血管類器官的產生流程。Doi:10.1038/s41581-019-0125-8
近年來，全球糖尿病的盛行率急速上升，糖尿病血管病變可能導致病患失明、腎衰竭、中風或是下肢截肢。以微觀的細胞機制而言，內皮細胞的損傷 [2] 會進而干擾與外被細胞 (pericyte) 之間的訊息傳遞 [3]，但內皮細胞與外被細胞如何導致血管病變仍然是未知的。團隊首先結合由多功能幹細胞分化出的內皮細胞與外被細胞，調節中胚層發育並建立標準化的複雜血管網絡類器官於 96 孔盤中 [4]（圖一）。移植這些類器官到免疫缺陷型小鼠的腎囊中，確認血管類器官可以在小鼠體內與原生血管連接並重複生長與存活 6 個月以上，病理切片分析發現細胞在體內分化為動脈、小動脈、毛細管和小靜脈（圖二）。基因標記分析更近一步證實這些小鼠體內建立的血管中 90％ 以上為人類來源。
圖二： hCD31 和 SMA 染色顯示，在移植類器官的小鼠體內產生了人的動脈、小動脈、毛細血管和小靜脈。Doi:10.1038/s41586-018-0858-8
為了研究這些類器官能否重現在臨床上的糖尿病血管病變，團隊將其暴露於高葡萄糖濃度溶液中，並以第二型糖尿病 (T2D) 病患的血管切片做對照；來自病患的切片顯示大量增厚的類洋蔥皮分層和典型的基底膜分裂，而暴露於高葡萄糖濃度的類器官顯示血管周圍的 IV 型膠原蛋白厚度顯著增加。糖尿病伴隨發炎狀態的產生，暴露於高葡萄糖的類器官與來自糖尿病病患的切片均有顯著 IV 型膠原蛋白厚度增加的狀態，證實類器官能有效呈現與臨床相同的病理狀態（圖三）。接著，團隊在移植類器官的小鼠以 streptozotocin 誘導糖尿病，結果與高葡萄糖暴露的類器官相似，小鼠的切片顯示了基底膜增厚的現象，還觀察到糖尿病血管病變的其他特徵，例如血管退化和內皮細胞損失，而血管的外被細胞和血管直徑則不受影響。
圖三： (a) PAS 染色（左）， IV 型膠原和層粘連蛋白免疫螢光分析了晚期 T2D 患者皮膚活檢中真皮毛細血管的基底膜增厚。 (b) 晚期 T2D 患者的皮膚毛細血管的代表性電子顯微鏡檢查。與非糖尿病對照（箭頭）相比， T2D 患者的基底膜異常厚（雙向箭頭）。E，內皮細胞； L，管腔； P，外被細胞。 (c) 基底膜增厚的代表圖（ IV 型膠原蛋白染色）。 (d) 使用血管橫截面定量基底膜增厚。Doi:10.1038/s41586-018-0858-8
接著，團隊使用多種糖尿病用藥於類器官與類器官移植小鼠，在阻斷所有已知造成糖尿病的細胞訊號路徑後，只有 γ-分泌酶抑制劑 DAPT 能阻止 IV 型膠原蛋白的擴張，DAPT 治療的糖尿病血管類器官恢復了內皮細胞的增殖性。通過 DAPT 治療也挽救過度的血管滲漏與糖尿病小鼠中的血管損失。進一步分析 DAPT 的標靶發現，抑制 DLL4 與 NOTCH3 訊號阻止了基底膜增厚的狀況。在以 CRISPR-Cas9 誘導 DLL4 與 NOTCH3 突變的類器官中也顯示基底膜增生顯著減少。在移植類器官小鼠檢測到 NOTCH3 及其下游 HES5 主要表現於外被細胞， NOTCH3 的表達與糖尿病和非糖尿病類器官上的表現相符。另外，在糖尿病與健康個體的血管中觀察到 NOTCH3 與 HES5 表現於外被細胞上（圖四），與移植類器官小鼠相符。
圖四： (b) 對患有 T2D （糖尿病）和健康非糖尿病患者的皮膚血管進行了 NOTCH3 和 SMA 染色。 (c) 在患有 T2D 和非糖尿病對照的患者的切片中分析了 HES5 和 SMA 的表達。 T2D 患者的外被細胞 (SMA) 中有很強的 HES5 信號。Doi:10.1038/s41586-018-0858-8
團隊先是證明血管類器官穩定地體外和體內呈現與臨床糖尿病血管病變相同的病理特徵，進一步以類器官於體外及體內模式發現並驗證了糖尿病藥物的作用標靶，DLL4 和 NOTCH3 被確定是人類糖尿病血管病變的關鍵驅動因素。因此，來自人類幹細胞的血管類器官可以真實地呈現人類血管的結構和功能，並可用於辨識糖尿病血管病變調節劑的系統。
參考文獻：
- R. A. Wimmer et al., Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature 565, 505-510 (2019). Doi:10.1038/s41586-018-0858-8
- G. Eelen, P. de Zeeuw, M. Simons, P. Carmeliet, Endothelial cell metabolism in normal and diseased vasculature. Circ Res 116, 1231-1244 (2015). Doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.302855
- N. Warmke, K. J. Griffin, R. M. Cubbon, Pericytes in diabetes-associated vascular disease. J Diabetes Complications 30, 1643-1650 (2016). Doi:10.1016/j.jdiacomp.2016.08.005
- R. A. Wimmer, A. Leopoldi, M. Aichinger, D. Kerjaschki, J. M. Penninger, Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc 14, 3082-3100 (2019). Doi:10.1038/s41596-019-0213-z
撰文｜洪維謙
審稿｜陳曦
