近年來小鼠的研究上已指出，懷孕期間因為感染 [1]、飲食習慣 [2] 等因素導致母體內微生物相 ( microbiota ) 出現菌叢不平衡 ( dysbiosis ) 的現象，與後代的腦部神經發育有關，並且能影響子代成年後的行為表現 [3]。但在重要的孕期間，以及在缺少環境刺激的情況下，母體腸道內的微生物是否對胎兒仍有影響，目前還沒有清楚的科學證據。美國洛杉磯加州大學的 Vuong 博士與其團隊於 2020 年在 Nature 的一篇文章，以減少母體腸道微生物相的手法，觀察發育中胚胎的腦部神經發育，得出懷孕母鼠的腸道微生物相能夠促進小鼠視丘皮質的軸突新生 ( thalamocortical axongenesis ) ，且可能是透過微生物的代謝產物為訊息傳遞的媒介，進而影響發育中的腦部神經 [4]。
本篇研究減少母鼠腸道微生物相的手法有兩種，其一是投放抗生素 ( antibiotic-treated，後續簡稱 ABX )，其二是將母鼠飼養在無菌環境 ( germ-free，後續簡稱 GF ) 中，以及飼養在一般無致病原的 ( specific pathogen-free，後續簡稱 SPF ) 環境作為對照組。整篇研究的起點從 RNA 定序的資料，找出有顯著表現差異的基因，其中 Netrin-G1a 蛋白 ( 表現在發育中的視丘皮質軸突 ) ，透過顯微免疫染色分析，在 ABX 以及 GF 母鼠的胚胎腦部視丘可以觀察到 Netrin-G1a+ 的軸突體積、長度以及密度， 都比 SPF 母鼠的胚胎來得短小 ( 圖一 )。另外，軸突新生的過程需有細胞外因子的參與來引導軸突生長的方向以及路徑，因此作者取出胚胎的視丘並直接培養在體外分別進行單獨培養，以及與下視丘 ( hypothalamus ) 和紋狀體 ( striatal ) 共同培養。結果顯示，ABX 和 GF 母鼠的胚胎，當其視丘與下視丘和紋狀體共同培養的時候，出現軸突生長減緩的現象，但單獨培養的時候卻沒有影響，這個結果指出了懷孕母鼠的微生物相如果減少，會擾亂小鼠胚胎的視丘對細胞外因子的反應，進而影響了其神經發育。
圖一、無特定致病原環境 ( specific pathogen-free, SPF )、投放抗生素 ( antibiotic-treated, ABX ) 以及無菌環境 ( germ-free, GF ) 母鼠的胚胎子代在胚胎期第 14.5 天的視丘組織分析。A. 由左至右為吻端到尾端，洋紅色是 Netrin-G1a，青綠色是 L1 ( 神經細胞附著分子蛋白 )；B. 全部的大腦中Netrin-G1a+ ( 洋紅色 ) 的範圍；C, D. 為 A. 中每條黃色虛線位置內的螢光密度。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2745-3. (revised)
有趣的是，如果將梭狀芽孢桿菌屬 ( Clostridia-dominant spore-forming ) 餵食給微生物相被減少的母鼠，可以避免胎兒視丘皮質軸突新生的異常 ( 圖二 )。母鼠血清以及其胚胎腦部的代謝物圖譜分析，顯示了母鼠的微生物相可以影響胚胎腦部中的代謝物種類以及組成。最後作者選擇表現量差異最大，並在體外實驗中驗證出能讓實驗組視丘有效恢復軸突數量的四種代謝產物，以腹腔注射的方式注入 ABX 母鼠體內，發現可以減少 ABX 胎鼠軸突新生異常，並讓軸突生長恢復到近似 SPF 胎鼠的軸突新生情況 ( 圖三 )。
圖二、將梭狀芽孢桿菌屬 ( Clostridia-dominant spore-forming ) 移入到微生物相被減少的母鼠，其子代在胚胎期第 14.5 天的視丘組織分析。A. 由左至右為吻端到尾端，洋紅色是 Netrin-G1a，青綠色是 L1；B. 全部的大腦中Netrin-G1a+ ( 洋紅色 ) 的範圍；C, D. 為 A. 中每條黃色虛線位置內的螢光密度；E, F. 在全部的大腦範圍中Netrin-G1a+ 的軸突體積與長度。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2745-3. (revised)
圖三、選擇的代謝產物作用於已被 ABX 減少微生物相的母鼠，其胚胎視丘於胚胎期第 14.5 天的組織分析。A. 不同的代謝產物與視丘與紋狀體 ( St ) 共同培養；TMAO：Trimethylamine-N-oxide；5-AV：5-aminovalerate ( TMAV: N, N, N-trimethyl-5-aminovalerate 的前驅物 )；IP：imidazole propionate；3-IS：3-indoxylsulfate；HIP：hippurate；B. 為 A. 中每 200 m2軸突的數量；C. 由左至右為吻端到尾端，洋紅色是 Netrin-G1a，青綠色是 L1；4-MM 為 TMAO, 5-AV, IP 和 HIP 的綜合；D. 為 C. 中每條黃色虛線位置內的螢光密度。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2745-3. (revised)
視丘作為感覺和運動神經元傳遞訊息的中繼站的同時，也參與其他神經認知的處理，例如語言和記憶等 [5]，為了瞭解微生物相對胚胎視丘軸突新生的影響，是否會連帶影響後代出生後的行為，作者透過一系列的觸覺行為實驗，發現母體微生物相的減少，讓成年後代的前後爪觸覺敏感度下降，但是在運動行為上並沒有差異，顯示母體微生物相在感覺迴路上有某種程度的影響。值得注意的是，食入特定菌種和選擇性補充代謝產物後，觸覺敏感度可以恢復到接近對照組的程度。
即使代謝物對神經發育的背後機制是什麼，以及是否還有別的腦區受到微生物相的影響仍不得而知，但此篇研究一步步拆解如何研究微生物相對胚胎神經發育的影響，同時還延續了對子代成年後的行為學觀察，成功地連結神經與行為的關係，並更具體地描繪出微生物相在神經發育中扮演的角色。
參考文獻：
[1] Kim, S., Kim, H., Yim, Y. S., Ha, S., Atarashi, K., Tan, T. G., …& Huh, J. R. (2017). Maternal gut bacteria promote neurodevelopmental abnormalities in mouse offspring. Nature, 549(7473), 528–532. doi: 10.1038/nature23910
[2] Buffington, S. A., Di Prisco, G. V., Auchtung, T. A., Ajami, N. J., Petrosino, J. F., & Costa-Mattioli, M. (2016). Microbial reconstitution reverses maternal diet-induced social and synaptic deficits in offspring. Cell, 165(7), 1762-1775. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.001
[3] Vuong, H. E., Yano, J. M., Fung, T. C., & Hsiao, E. Y. (2017). The microbiome and host behavior. Annual Review of Neuroscience, 40, 21-49. doi: 10.1146/annurev-neuro-072116-031347
[4] Vuong, H. E., Pronovost, G. N., Williams, D. W., Coley, E. J. L., Siegler, E. L., Qiu, A., … & Hsiao E. Y. (2020). The maternal microbiome modulates fetal neurodevelopment in mice. Nature, 586(7828), 281-286. doi: 10.1038/s41586-020-2745-3
[5] Herrero, M.-T., Barcia, C., & Navarro, J. M. (2002). Functional anatomy of thalamus and basal ganglia. Child’s Nervous System, 18(8), 386-404. doi: 10.1007/s00381-002-0604-1
撰文｜黃玟瑜
審稿｜林琲瑢
