cGAS的新身分：不只是人體的免疫哨兵，還是 DNA 複製叉的減速器

隨著環鳥苷酸–腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）的結構，以及它如何辨識細胞質中特定的外來 DNA 並啟動先天性免疫防衛的機制被揭開之後 [1]，有關 cGAS 的研究開始受到科學界的關注。目前已經知道 cGAS 在與異常或外來的 DNA 結合之後，會合成 cGAMP（cyclic GMP-AMP）作為第二傳訊因子，往下活化干擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes，STING），提高第一型干擾素（Type I interferon）的表現，使許多能驅動免疫細胞反應的關鍵細胞因子得以生成 [2]（圖一）。除此之外，cGAS 對於監測細胞核中的基因體是否有異狀也有貢獻 [3]。然而 cGAS 在癌症領域中的定位就比較複雜，一方面如前所述 cGAS-STING 可以啟動先天性免疫反應，因此有對抗癌細胞的作用；但另一方面，在特定的情境之下 cGAS-STING 也可能因為其引發的發炎反應，反而加速癌細胞的惡化，甚至出現轉移的狀況 [4]。

值得注意的是，有些癌細胞能夠抑制 STING 的表現或是使其失去作用，來躲避 cGAS-STING 誘發的先天性免疫反應 [5]。不過有趣的是，在癌細胞中， cGAS 反而很少被抑制。這代表 cGAS 對癌細胞來說可能有無法割捨的重要性，更重要的是，發揮這項功能跟 STING 沒有關係。而本篇研究的重點就在於作者們發現 cGAS 能獨立於 STING 之外，在細胞進行 DNA 複製時，出現在細胞核之中與 DNA 結合，並與負責 DNA 複製的蛋白們互動，減緩複製叉（Replication fork）繼續前進的腳步，以避免複製叉行進過快而帶來的複製壓力 ( DNA replicaiton stress ) [6]。

研究團隊首先利用了 CRISPR-Cas9 技術製造出 cGAS-/- 的人類與老鼠纖維細胞，發現相較於野生型（Wild type，cGAS 表現正常），缺少 cGAS 的細胞表現出較快的增生速度；在不表現 STING 的 U2OS 細胞（人類骨肉瘤細胞）中，移除 cGAS 同樣使細胞增生速率加快（圖二、A-C），顯示 cGAS 影響細胞增生的速率與 STING 無關。團隊還設計了不同突變點位的 cGAS 蛋白，利用質體轉染的方法使 U2OS cGAS-/- 細胞進行表現，結果顯示如果突變位點與 cGAS 轉移到細胞核 ( Nuclear translocation ) 或跟 DNA 結合的功能有關，則細胞生長的速率跟 cGAS 缺失的對照組幾乎一樣，顯示cGAS調控細胞增生與其細胞核轉移及DNA結合能力相關。然而，失去合成 cGAMP 功能的 cGAS（161-522 胺基酸片段中第171-174 出現突變）細胞生長的速度跟具有完整功能的 cGAS 相同（圖二、D-E），表示 cGAS 對細胞增生速率的調控，除了 STING 之外，也不受 cGAMP 的影響。

從 DNA 複製的角度來看，cGAS-/- 細胞在 S-phase（細胞週期中進行 DNA 複製的階段）時，新生的 DNA 的比例比野生型細胞來得高（圖三、A-B）。透過 DNA 纖維分析，發現 cGAS-/- 細胞相較野生型有更長的 DNA 纖維，且有更多新複製叉的生成（圖三、C-E）。當使用羥基尿素（Hydroxyurea，HU; 註一）強迫複製叉暫停一段時間之後，在30分鐘之內就有超過 90 % 的 cGAS-/- 細胞合成出新生DNA，相較之下，只有大約 40 % 的野生型細胞在兩個小時內有新生DNA。除此之外，缺少 cGAS 的情況下，被 HU 暫停的複製叉較容易被核酸酶降解，顯示 cGAS 也跟被暫停的複製叉穩定性有關（圖三、E-G）。RNA 定序分析的結果也顯示，當 cGAS 缺失時，與 DNA 複製以及細胞週期相關的基因表現都有顯著的提高。值得一提的是，連 DNA 修復的基因表現也增強了。研究團隊進一步觀察了 ATR（Ataxia telangiectasia and Rad3-related）與 Chk1（Checkpoint kinase 1）這兩個主要偵測 DNA 複製壓力的蛋白的表現，發現活化狀態的 ATR 與 Chk1 在cGAS-/- 細胞相較野生型都有顯著的增加。這些結果顯示 cGAS 的缺失賦予了細胞「過度複製（hyper-replicative）」的狀態，雖然 DNA 生成速率增快，卻變得相對不穩定，使其對會造成 DNA 損傷的刺激的反應更加敏感，例如輻射線照射，或是具有基因毒性的化療藥物。

最後，透過質譜儀分析，研究團隊找到跟 cGAS 有相互作用的蛋白，其中增生細胞核抗原（Proliferation cell nuclear antigen，PCNA：在 DNA 複製的時候會夾住雙股 DNA 模板進行滑動，其中一端連著聚合酶δ，確保聚合酶能好好待在模板鏈上工作）與 cGAS 不只同樣坐落在細胞核中，透過免疫沉澱法更進一步發現，cGAS 的存在與否並不影響 PCNA 與其它複製叉蛋白的互動，顯示 cGAS 可能只是作為一個「路障」，擋在了複製叉前進的路上，而不是影響複製叉蛋白整體的穩定性。

事實上，已經有研究在探討在使用免疫抑制檢查點抑制劑的時候，搭配使用能夠阻礙細胞複製的藥物，誘發基因體的不穩定性，使癌細胞中的 cGAS-STING 路徑得已被活化，藉此釋放出能夠吸引 T 細胞聚集的細胞因子，加強其滲透的效果，克服 T 細胞無法有效進入腫瘤位置的困難 [7]。

延伸閱讀：癌症與免疫系統的攻防戰：免疫檢查點療法  

然而，如開頭所述，癌細胞會透過抑制 STING 的表現來避開這項機制的威脅，因此本篇研究發現 cGAS 對基因穩定性的貢獻獨立於 STING 之外，有可能是大部分癌細胞都保留 cGAS 表現的原因，使其能在放射線治療以及化療的攻擊下存活下來。未來 cGAS 不只有機會成為合併免疫療法的新目標，也有望成為新興抗癌藥物的標的。

註一：Hydroxyurea (HU)是一種核糖核酸還原酶 ( Ribonucleotide reductase ) 的抑制劑，會使DNA複製所需要的去氧核醣核酸無法順利合成，進而阻礙DNA複製進行，因此HU為一典型的複製壓力誘導劑。

註二：在 cGAS 與 DNA 結合的時候，會形成一種液態狀的水滴，將活化狀態的 cGAS 與 DNA 包裹在裡面，這個現象被稱為相分離（Phase separation）[8]。

參考文獻：

[1] W. Zhou et al., “Structure of the human cGAS–DNA complex reveals enhanced control of immune surveillance,” Cell, vol. 174, no. 2, pp. 300-311.e11, Jul. 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.06.026.

[2] T. Li and Z. J. Chen, “The cGAS–cGAMP–STING pathway connects DNA damage to inflammation, senescence, and cancer,” J. Exp. Med., vol. 215, no. 5, pp. 1287–1299, May 2018, doi: 10.1084/jem.20180139.

[3] F. Coquel et al., “SAMHD1 acts at stalled replication forks to prevent interferon induction,” Nature, vol. 557, no. 7703, Art. no. 7703, May 2018, doi: 10.1038/s41586-018-0050-1.

[4] J. Kwon and S. F. Bakhoum, “The cytosolic DNA-sensing cGAS-STING pathway in cancer,” Cancer Discov., vol. 10, no. 1, pp. 26–39, Jan. 2020, doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0761.

[5] Y.-A. Chen, Y.-L. Shen, H.-Y. Hsia, Y.-P. Tiang, T.-L. Sung, and L.-Y. Chen, “Extrachromosomal telomere repeat DNA is linked to ALT development via cGAS-STING DNA sensing pathway,” Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 24, no. 12, pp. 1124–1131, Dec. 2017, doi: 10.1038/nsmb.3498.

[6] H. Chen et al., “cGAS suppresses genomic instability as a decelerator of replication forks,” Sci. Adv., vol. 6, no. 42, p. eabb8941, Oct. 2020, doi: 10.1126/sciadv.abb8941.

[7] T. Sen et al., “Targeting DNA Damage Response Promotes Antitumor Immunity through STING-Mediated T-cell Activation in Small Cell Lung Cancer,” Cancer Discov., vol. 9, no. 5, pp. 646–661, May 2019, doi: 10.1158/2159-8290.CD-18-1020.

[8] M. Du and Z. J. Chen, “DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling,” Science, vol. 361, no. 6403, pp. 704–709, Aug. 2018, doi: 10.1126/science.aat1022.

關鍵字：基因與基因體學、科學報導、基因穩定性、基因複製
撰文｜黃玟瑜
審稿｜蕭皓文