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cGAS的新身分:不只是人體的免疫哨兵,還是 DNA 複製叉的減速器

隨著環鳥苷酸腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthasecGAS)的結構,以及它如何辨識細胞質中特定的外來 DNA 並啟動先天性免疫防衛的機制被揭開之後 [1],有關 cGAS 的研究開始受到科學界的關注。目前已經知道 cGAS 在與異常或外來的 DNA 結合之後,會合成 cGAMPcyclic GMP-AMP)作為第二傳訊因子,往下活化干擾素基因刺激蛋白(Stimulator of interferon genesSTING),提高第一型干擾素(Type I interferon)的表現,使許多能驅動免疫細胞反應的關鍵細胞因子得以生成 [2](圖一)。除此之外,cGAS 對於監測細胞核中的基因體是否有異狀也有貢獻 [3]。然而 cGAS 在癌症領域中的定位就比較複雜,一方面如前所述 cGAS-STING 可以啟動先天性免疫反應,因此有對抗癌細胞的作用;但另一方面,在特定的情境之下 cGAS-STING 也可能因為其引發的發炎反應,反而加速癌細胞的惡化,甚至出現轉移的狀況 [4]

圖片來源:https://doi.org/10.1084/jem.20180139
圖片說明:圖一、cGAS-STING偵測到細胞質中受損或外來的 DNA,並活化第一型干擾素(type I interferon)與其它細胞因子的路徑圖。

值得注意的是,有些癌細胞能夠抑制 STING 的表現或是使其失去作用,來躲避 cGAS-STING 誘發的先天性免疫反應 [5]。不過有趣的是,在癌細胞中, cGAS 反而很少被抑制。這代表 cGAS 對癌細胞來說可能有無法割捨的重要性,更重要的是,發揮這項功能跟 STING 沒有關係。而本篇研究的重點就在於作者們發現 cGAS 能獨立於 STING 之外,在細胞進行 DNA 複製時,出現在細胞核之中與 DNA 結合,並與負責 DNA 複製的蛋白們互動,減緩複製叉(Replication fork)繼續前進的腳步,以避免複製叉行進過快而帶來的複製壓力 ( DNA replicaiton stress ) [6]

研究團隊首先利用了 CRISPR-Cas9 技術製造出 cGAS-/- 的人類與老鼠纖維細胞,發現相較於野生型(Wild typecGAS 表現正常),缺少 cGAS 的細胞表現出較快的增生速度;在不表現 STING U2OS 細胞(人類骨肉瘤細胞)中,移除 cGAS 同樣使細胞增生速率加快(圖二、A-C),顯示 cGAS 影響細胞增生的速率與 STING 無關。團隊還設計了不同突變點位的 cGAS 蛋白,利用質體轉染的方法使 U2OS cGAS-/- 細胞進行表現,結果顯示如果突變位點與 cGAS 轉移到細胞核 ( Nuclear translocation ) 或跟 DNA 結合的功能有關,則細胞生長的速率跟 cGAS 缺失的對照組幾乎一樣,顯示cGAS調控細胞增生與其細胞核轉移及DNA結合能力相關。然而,失去合成 cGAMP 功能的 cGAS(161-522 胺基酸片段中第171-174 出現突變)細胞生長的速度跟具有完整功能的 cGAS 相同(圖二、D-E),表示 cGAS 對細胞增生速率的調控,除了 STING 之外,也不受 cGAMP 的影響。

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圖片說明:圖二、cGAS 在細胞核中與 DNA 結合是抑制細胞增生速率的關鍵,且不需要 STING 與 cGAMP 的存在。cGAS-/-:剔除 cGAS 基因;cGAS-OE:過度表現 cGAS 基因(Overexpression,OE)。(D) FL cGAS:Full-length cGAS,保留 cGAS 完整長度與功能;161-522:只有 166-522 胺基酸片段,保留了 cGAMP 合成的功能但無法進行相分離(Phase separation;註二);161-522 ∆ 171-174:第 171-174 胺基酸突變,失去 cGAMP 合成的活性;Y215E 位點突變:使 cGAS 無法轉移到細胞核;K347E 位點突變:阻礙 cGAS 形成二聚合體(Dimerization),但不影響與 DNA 結合的能力,;K394E 位點突變:阻礙 cGAS 與 DNA 的結合。

DNA 複製的角度來看,cGAS-/- 細胞在 S-phase(細胞週期中進行 DNA 複製的階段)時,新生的 DNA 的比例比野生型細胞來得高(圖三、A-B)。透過 DNA 纖維分析,發現 cGAS-/- 細胞相較野生型有更長的 DNA 纖維,且有更多新複製叉的生成(圖三、C-E)。當使用羥基尿素(HydroxyureaHU; 註一)強迫複製叉暫停一段時間之後,在30分鐘之內就有超過 90 % cGAS-/- 細胞合成出新生DNA,相較之下,只有大約 40 % 的野生型細胞在兩個小時內有新生DNA。除此之外,缺少 cGAS 的情況下,被 HU 暫停的複製叉較容易被核酸酶降解,顯示 cGAS 也跟被暫停的複製叉穩定性有關(圖三、E-G)。RNA 定序分析的結果也顯示,當 cGAS 缺失時,與 DNA 複製以及細胞週期相關的基因表現都有顯著的提高。值得一提的是,連 DNA 修復的基因表現也增強了。研究團隊進一步觀察了 ATRAtaxia telangiectasia and Rad3-related)與 Chk1Checkpoint kinase 1)這兩個主要偵測 DNA 複製壓力的蛋白的表現,發現活化狀態的 ATR Chk1 cGAS-/- 細胞相較野生型都有顯著的增加。這些結果顯示 cGAS 的缺失賦予了細胞「過度複製(hyper-replicative)」的狀態,雖然 DNA 生成速率增快,卻變得相對不穩定,使其對會造成 DNA 損傷的刺激的反應更加敏感,例如輻射線照射,或是具有基因毒性的化療藥物。

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圖片說明:圖三、cGAS 缺失賦予了細胞過度複製的狀態,並與 DNA 複製缺失相關。

最後,透過質譜儀分析,研究團隊找到跟 cGAS 有相互作用的蛋白,其中增生細胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigenPCNA:在 DNA 複製的時候會夾住雙股 DNA 模板進行滑動,其中一端連著聚合酶δ,確保聚合酶能好好待在模板鏈上工作)與 cGAS 不只同樣坐落在細胞核中,透過免疫沉澱法更進一步發現,cGAS 的存在與否並不影響 PCNA 與其它複製叉蛋白的互動,顯示 cGAS 可能只是作為一個「路障」,擋在了複製叉前進的路上,而不是影響複製叉蛋白整體的穩定性。

事實上,已經有研究在探討在使用免疫抑制檢查點抑制劑的時候,搭配使用能夠阻礙細胞複製的藥物,誘發基因體的不穩定性,使癌細胞中的 cGAS-STING 路徑得已被活化,藉此釋放出能夠吸引 T 細胞聚集的細胞因子,加強其滲透的效果,克服 T 細胞無法有效進入腫瘤位置的困難 [7]

延伸閱讀:癌症與免疫系統的攻防戰:免疫檢查點療法  

然而,如開頭所述,癌細胞會透過抑制 STING 的表現來避開這項機制的威脅,因此本篇研究發現 cGAS 對基因穩定性的貢獻獨立於 STING 之外,有可能是大部分癌細胞都保留 cGAS 表現的原因,使其能在放射線治療以及化療的攻擊下存活下來。未來 cGAS 不只有機會成為合併免疫療法的新目標,也有望成為新興抗癌藥物的標的。

註一:Hydroxyurea (HU)是一種核糖核酸還原酶 ( Ribonucleotide reductase ) 的抑制劑,會使DNA複製所需要的去氧核醣核酸無法順利合成,進而阻礙DNA複製進行,因此HU為一典型的複製壓力誘導劑。

註二:在 cGAS 與 DNA 結合的時候,會形成一種液態狀的水滴,將活化狀態的 cGAS 與 DNA 包裹在裡面,這個現象被稱為相分離(Phase separation)[8]。

參考文獻:

[1] W. Zhou et al., “Structure of the human cGAS–DNA complex reveals enhanced control of immune surveillance,” Cell, vol. 174, no. 2, pp. 300-311.e11, Jul. 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.06.026.

[2] T. Li and Z. J. Chen, “The cGAS–cGAMP–STING pathway connects DNA damage to inflammation, senescence, and cancer,” J. Exp. Med., vol. 215, no. 5, pp. 1287–1299, May 2018, doi: 10.1084/jem.20180139.

[3] F. Coquel et al., “SAMHD1 acts at stalled replication forks to prevent interferon induction,” Nature, vol. 557, no. 7703, Art. no. 7703, May 2018, doi: 10.1038/s41586-018-0050-1.

[4] J. Kwon and S. F. Bakhoum, “The cytosolic DNA-sensing cGAS-STING pathway in cancer,” Cancer Discov., vol. 10, no. 1, pp. 26–39, Jan. 2020, doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0761.

[5] Y.-A. Chen, Y.-L. Shen, H.-Y. Hsia, Y.-P. Tiang, T.-L. Sung, and L.-Y. Chen, “Extrachromosomal telomere repeat DNA is linked to ALT development via cGAS-STING DNA sensing pathway,” Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 24, no. 12, pp. 1124–1131, Dec. 2017, doi: 10.1038/nsmb.3498.

[6] H. Chen et al., “cGAS suppresses genomic instability as a decelerator of replication forks,” Sci. Adv., vol. 6, no. 42, p. eabb8941, Oct. 2020, doi: 10.1126/sciadv.abb8941.

[7] T. Sen et al., “Targeting DNA Damage Response Promotes Antitumor Immunity through STING-Mediated T-cell Activation in Small Cell Lung Cancer,” Cancer Discov., vol. 9, no. 5, pp. 646–661, May 2019, doi: 10.1158/2159-8290.CD-18-1020.

[8] M. Du and Z. J. Chen, “DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling,” Science, vol. 361, no. 6403, pp. 704–709, Aug. 2018, doi: 10.1126/science.aat1022.

關鍵字:基因與基因體學、科學報導、基因穩定性、基因複製
撰文|黃玟瑜
審稿|蕭皓文

About the author

黃玟瑜

黃玟瑜

畢業於陽明大學醫學生物技術暨檢驗學系,畢業後在醫療器材產業界工作三年,對最終能應用到市場或是臨床的知識產生興趣,因此申請了以 Translation medicine 為核心的 Erasmus Master Program - International Master in Innovative Medicine,前後分別在瑞典 Uppsala University 以及荷蘭 Groningen University 就讀,期待能融合基礎研究轉譯到臨床研究,再應用到市場的思維。很開心能加入 The Investigator Taiwan ,跟許多厲害的人一起交流更多科學或是產業的想法。

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