分子生物學 基因與基因體學 基因體學 科學報導

多功能的 MCM 蛋白:不只啟動 DNA 複製,更可控制複製速度

DNA 的複製需要 DNA 解旋酶(DNA helicase)將雙股纏繞的 DNA 解開,以形成複製叉讓 DNA 複製能順利啟動。其中,微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein,MCM 蛋白)即是一種 DNA 解旋酶,由 6 個次單元體(MCM2-7)所組成的複合體,他不只與啟動 DNA 複製有關,在 DNA 複製的延長、後續轉錄甚至基因體的穩定都有作用。在 DNA 開始複製前,大量 MCM 蛋白會與染色質(chromatin)結合,形成複製前複合體(pre-replication complexes,pre-RCs),但只有一小部分的 pre-RC 會成功活化開始複製,其餘過量的 pre-RC 功能尚且不明,是科學家百思不得其解的 MCM 悖論(MCM paradox)[1]。

來自丹麥哥本哈根大學的團隊 [2] 即試圖解釋 MCM 悖論,他們的研究發現細胞中的大量 MCM 蛋白不只回收自 pre-RC 中,也透過合成增加數量。回收的 MCM 蛋白更穩定、更易於使 pre-RC 成功活化,而新合成的 MCM 蛋白卻額外需要與 MCM 結合蛋白(maintenance complex-binding protein,MCMBP)結合以穩定下來,並被運送到細胞核內(pre-RC 形成場所),而他們進一步的新發現是這些與 MCMBP 結合而穩定的 MCM 蛋白能限制 DNA 複製進行的速率以降低錯誤發生,解釋了過量 MCM 蛋白的存在原因。

團隊運用 CRISPR-Cas9 技術使人類 U2OS 細胞(人骨肉瘤細胞)表現帶有特殊標記: HaloTag 的 MCM 蛋白,再在不同時間點加入可針對 HaloTag 激發出不同螢光的不同配體(ligand),即可定量新舊 MCM 蛋白並進行後續研究。此處舊 MCM 蛋白為至少在過往細胞週期中曾與染色質結合過一次的 MCM 蛋白;新 MCM 蛋白則為該次細胞週期中所合成的。

研究顯示在一次細胞週期間,舊 MCM 蛋白含量會逐漸降低,而新 MCM 蛋白會被合成而使總量穩定維持不變,新 MCM 蛋白含量能達到舊 MCM 蛋白含量的兩倍以上(圖一a),且在與染色質的結合也是相似比例(圖一b),然而若是在成功活化的 pre-RC 中,新舊 MCM 蛋白卻各佔一半(圖一c),顯示舊 MCM 蛋白較易使 pre-RC 活化。動力學分析上也發現舊 MCM 蛋白與染色質的分離速率較慢,團隊推測或許是 MCM 蛋白在與染色質結合過後,出現了轉譯後修飾所導致。

圖一:新舊 MCM 蛋白在細胞週期不同時間點的含量。Nascent MCM4 為新合成 MCM 蛋白(圖中以洋紅標示),Parental MCM4 為舊 MCM 蛋白(圖中以綠色標示)。(a) DNA 複製期間(S phase)新合成 MCM 蛋白 含量增加 (b) 新合成 MCM 蛋白與染色質結合比例較多(c) 在成功活化的 pre-RC中,新舊 MCM蛋白各佔一半。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3

那這些過量新合成的 MCM 蛋白又是如何能穩定累積在細胞中不被分解呢?如果他們持續存在於細胞中,是否帶有特定功能呢?團隊認為 MCMBP 或許是關鍵,而複製叉的穩定可能與其有關。他們讓細胞表現帶有 degron (降解決定子)的 MCMBP,使胞內 MCMBP 是易於被降解的,為了方便調控,採用了會被 IAA (Indole-3-acetic acid,生長素的一種)活化的 degron,加入 IAA 即可讓胞內 MCMBP 含量減少,再進一步分析與 DNA 複製相關的複合體含量。結果顯示,缺少了 MCMBP 會減少細胞核內新 MCM 蛋白的累積、減少 pre-RC 含量,但並不影響最終成功活化的 pre-RC 總量(圖二 a、b),不過 DNA 的損壞卻也增加(圖二 b、c)。

圖二、加入 IAA 致使胞內缺乏 MCMBP 後的影響。(a) 減緩核內新 MCM 蛋白的累積。(b) 缺乏 MCMBP 時,(S phase) DNA 損壞標記:γH2AX 的含量增加、pre-RC減少(以 MCM7 為代表)、最終活化的複製體 PCNA 數量維持。(c) 缺乏 MCMBP 時,DNA 複製過程中(S phase) DNA 損壞標記:γH2AX 的定量。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3

此外值得一提的是,在細胞質內被合成的 MCM 蛋白次單元體似乎透過不同途徑進入細胞核。已知 MCMBP、 MCM2 和 MCM3 都帶有入核所需的核定位序列(nuclear localization signal, NLS),但缺少了 MCMBP 只會讓 MCM3-7 在細胞質中滯留(圖三 a,以 MCM4 訊號與含量代表),不影響 MCM2 在細胞質中的含量(圖三 b);如果在剔除了 MCMBP 的細胞中補入不具有 NLS 序列的 MCMBP,也同樣只讓 MCM3-7 滯留在細胞質中(圖三 c)。這些結果說明 MCM3-7 和 MCM2 是分別進入細胞核後再行組裝,而 MCM3 帶有的 NLS 可能不夠強,才需要 MCMBP 的協助以順利入核。

圖三、MCM蛋白次單元體入核機制不同。(a) (b) 缺少 MCMBP 對 MCM 蛋白入核影響:(a) 左半為抗 MCM4 抗體染色結果,右半為細胞質內 MCM4 定量結果。(b) 左半為抗 MCM2 抗體染色結果,右半為細胞質內 MCM2 定量結果。(c) 剔除 MCMBP(MCMBP KO)、剔除 MCMBP 再補入 MCMBP(+MCMBP) 或不具有 NLS 的 MCMBP(+MCMBP ΔNLS)時對細胞質內 MCM3-7 (左半)及 MCM2(右半)含量影響。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3

最後團隊針對前述缺乏 MCMBP 造成 DNA 損壞增加的現象(圖二 b)進行探討,發現缺少 MCMBP 會加快複製叉的行進速度(圖四 a),究其機制,可能原因為不對稱的複製叉出現機率的提高(圖四 b)。

圖四、MCM 蛋白與 MCMBP 對 DNA 複製叉的影響。DMSO 為控制組,IAA 組為缺乏 MCMBP 組;siCTRL 為控制組 siRNA,siCDC6 為降低 CDC6(pre-RC 組成蛋白之一)表現的 siRNA。(a) 缺少 MCMBP 時(紅色組別),複製叉速度會增加。(b) 缺少 MCMBP 時(紅色組別),複製叉變得不對稱。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3

透過本研究的實驗結果,團隊了解 MCM 蛋白在細胞核內的穩定累積與 MCMBP 息息相關,而過量的 MCM 蛋白不止是作為備援,其更重要的功能之一在於透過與 MCMBP 的結合管控 DNA 複製叉前進速率,如此不但解釋了過往研究發現的 MCM 蛋白含量與腫瘤發生率、基因體穩定的關聯性 [3] [4],而 MCMBP 或許也能成為增加細胞複製壓力的標靶,弱化癌細胞、提升現有癌症療法的成效。

參考文獻:

[1] Das M, Singh S, Pradhan S, Narayan G. MCM Paradox: Abundance of Eukaryotic Replicative Helicases and Genomic Integrity. Mol Biol Int. 2014, 1-11
[2] Sedlackova, H., Rask, MB., Gupta, R. et al. Equilibrium between nascent and parental MCM proteins protects replicating genomes. Nature 587, 297–302 (2020).
[3] Shima, N. et al. A viable allele of Mcm4 causes chromosome instability and mammary adenocarcinomas in mice. Nat. Genet. 39, 93–98 (2007).
[4] Kawabata, T. et al. Stalled fork rescue via dormant replication origins in unchallenged S phase promotes proper chromosome segregation and tumor suppression. Mol. Cell 41, 543–553 (2011).

關鍵字:MCM蛋白、DNA複製、基因體穩定性、2021/05/DNA replication主題月

撰文|黃云宣
審稿|蕭皓文

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黃云宣

TU Dresden 分子生物工程研究所學生,國立臺灣大學生化科技學系畢,研究領域為蛋白質化學、結構生物學。曾參與 2015 iGEM,曾任系學會系刊部長、生科院院學會秘書、臺大畢聯會公關部長。

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