DNA 的複製需要 DNA 解旋酶（DNA helicase）將雙股纏繞的 DNA 解開，以形成複製叉讓 DNA 複製能順利啟動。其中，微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance protein，MCM 蛋白）即是一種 DNA 解旋酶，由 6 個次單元體（MCM2-7）所組成的複合體，他不只與啟動 DNA 複製有關，在 DNA 複製的延長、後續轉錄甚至基因體的穩定都有作用。在 DNA 開始複製前，大量 MCM 蛋白會與染色質（chromatin）結合，形成複製前複合體（pre-replication complexes，pre-RCs），但只有一小部分的 pre-RC 會成功活化開始複製，其餘過量的 pre-RC 功能尚且不明，是科學家百思不得其解的 MCM 悖論（MCM paradox）[1]。
來自丹麥哥本哈根大學的團隊 [2] 即試圖解釋 MCM 悖論，他們的研究發現細胞中的大量 MCM 蛋白不只回收自 pre-RC 中，也透過合成增加數量。回收的 MCM 蛋白更穩定、更易於使 pre-RC 成功活化，而新合成的 MCM 蛋白卻額外需要與 MCM 結合蛋白（maintenance complex-binding protein，MCMBP）結合以穩定下來，並被運送到細胞核內（pre-RC 形成場所），而他們進一步的新發現是這些與 MCMBP 結合而穩定的 MCM 蛋白能限制 DNA 複製進行的速率以降低錯誤發生，解釋了過量 MCM 蛋白的存在原因。
團隊運用 CRISPR-Cas9 技術使人類 U2OS 細胞（人骨肉瘤細胞）表現帶有特殊標記： HaloTag 的 MCM 蛋白，再在不同時間點加入可針對 HaloTag 激發出不同螢光的不同配體（ligand），即可定量新舊 MCM 蛋白並進行後續研究。此處舊 MCM 蛋白為至少在過往細胞週期中曾與染色質結合過一次的 MCM 蛋白；新 MCM 蛋白則為該次細胞週期中所合成的。
研究顯示在一次細胞週期間，舊 MCM 蛋白含量會逐漸降低，而新 MCM 蛋白會被合成而使總量穩定維持不變，新 MCM 蛋白含量能達到舊 MCM 蛋白含量的兩倍以上（圖一a），且在與染色質的結合也是相似比例（圖一b），然而若是在成功活化的 pre-RC 中，新舊 MCM 蛋白卻各佔一半（圖一c），顯示舊 MCM 蛋白較易使 pre-RC 活化。動力學分析上也發現舊 MCM 蛋白與染色質的分離速率較慢，團隊推測或許是 MCM 蛋白在與染色質結合過後，出現了轉譯後修飾所導致。
圖一：新舊 MCM 蛋白在細胞週期不同時間點的含量。Nascent MCM4 為新合成 MCM 蛋白（圖中以洋紅標示），Parental MCM4 為舊 MCM 蛋白（圖中以綠色標示）。(a) DNA 複製期間（S phase）新合成 MCM 蛋白 含量增加 (b) 新合成 MCM 蛋白與染色質結合比例較多(c) 在成功活化的 pre-RC中，新舊 MCM蛋白各佔一半。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
那這些過量新合成的 MCM 蛋白又是如何能穩定累積在細胞中不被分解呢？如果他們持續存在於細胞中，是否帶有特定功能呢？團隊認為 MCMBP 或許是關鍵，而複製叉的穩定可能與其有關。他們讓細胞表現帶有 degron （降解決定子）的 MCMBP，使胞內 MCMBP 是易於被降解的，為了方便調控，採用了會被 IAA （Indole-3-acetic acid，生長素的一種）活化的 degron，加入 IAA 即可讓胞內 MCMBP 含量減少，再進一步分析與 DNA 複製相關的複合體含量。結果顯示，缺少了 MCMBP 會減少細胞核內新 MCM 蛋白的累積、減少 pre-RC 含量，但並不影響最終成功活化的 pre-RC 總量（圖二 a、b），不過 DNA 的損壞卻也增加（圖二 b、c）。
圖二、加入 IAA 致使胞內缺乏 MCMBP 後的影響。(a) 減緩核內新 MCM 蛋白的累積。(b) 缺乏 MCMBP 時，（S phase） DNA 損壞標記：γH2AX 的含量增加、pre-RC減少（以 MCM7 為代表）、最終活化的複製體 PCNA 數量維持。(c) 缺乏 MCMBP 時，DNA 複製過程中（S phase） DNA 損壞標記：γH2AX 的定量。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
此外值得一提的是，在細胞質內被合成的 MCM 蛋白次單元體似乎透過不同途徑進入細胞核。已知 MCMBP、 MCM2 和 MCM3 都帶有入核所需的核定位序列（nuclear localization signal, NLS），但缺少了 MCMBP 只會讓 MCM3-7 在細胞質中滯留（圖三 a，以 MCM4 訊號與含量代表），不影響 MCM2 在細胞質中的含量（圖三 b）；如果在剔除了 MCMBP 的細胞中補入不具有 NLS 序列的 MCMBP，也同樣只讓 MCM3-7 滯留在細胞質中（圖三 c）。這些結果說明 MCM3-7 和 MCM2 是分別進入細胞核後再行組裝，而 MCM3 帶有的 NLS 可能不夠強，才需要 MCMBP 的協助以順利入核。
圖三、MCM蛋白次單元體入核機制不同。(a) (b) 缺少 MCMBP 對 MCM 蛋白入核影響：(a) 左半為抗 MCM4 抗體染色結果，右半為細胞質內 MCM4 定量結果。(b) 左半為抗 MCM2 抗體染色結果，右半為細胞質內 MCM2 定量結果。(c) 剔除 MCMBP（MCMBP KO）、剔除 MCMBP 再補入 MCMBP（+MCMBP） 或不具有 NLS 的 MCMBP（+MCMBP ΔNLS）時對細胞質內 MCM3-7 (左半）及 MCM2（右半）含量影響。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
最後團隊針對前述缺乏 MCMBP 造成 DNA 損壞增加的現象（圖二 b）進行探討，發現缺少 MCMBP 會加快複製叉的行進速度（圖四 a），究其機制，可能原因為不對稱的複製叉出現機率的提高（圖四 b）。
圖四、MCM 蛋白與 MCMBP 對 DNA 複製叉的影響。DMSO 為控制組，IAA 組為缺乏 MCMBP 組；siCTRL 為控制組 siRNA，siCDC6 為降低 CDC6（pre-RC 組成蛋白之一）表現的 siRNA。(a) 缺少 MCMBP 時（紅色組別），複製叉速度會增加。(b) 缺少 MCMBP 時（紅色組別），複製叉變得不對稱。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
透過本研究的實驗結果，團隊了解 MCM 蛋白在細胞核內的穩定累積與 MCMBP 息息相關，而過量的 MCM 蛋白不止是作為備援，其更重要的功能之一在於透過與 MCMBP 的結合管控 DNA 複製叉前進速率，如此不但解釋了過往研究發現的 MCM 蛋白含量與腫瘤發生率、基因體穩定的關聯性 [3] [4]，而 MCMBP 或許也能成為增加細胞複製壓力的標靶，弱化癌細胞、提升現有癌症療法的成效。
參考文獻：
[1] Das M, Singh S, Pradhan S, Narayan G. MCM Paradox: Abundance of Eukaryotic Replicative Helicases and Genomic Integrity. Mol Biol Int. 2014, 1-11 https://doi.org/10.1155/2014/574850
[2] Sedlackova, H., Rask, MB., Gupta, R. et al. Equilibrium between nascent and parental MCM proteins protects replicating genomes. Nature 587, 297–302 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
[3] Shima, N. et al. A viable allele of Mcm4 causes chromosome instability and mammary adenocarcinomas in mice. Nat. Genet. 39, 93–98 (2007). https://doi.org/10.1038/ng1936
[4] Kawabata, T. et al. Stalled fork rescue via dormant replication origins in unchallenged S phase promotes proper chromosome segregation and tumor suppression. Mol. Cell 41, 543–553 (2011). https://doi.org/10.1016/j.molcel.2011.02.006
撰文｜黃云宣
審稿｜蕭皓文
