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具備抗癌藥物潛力的海綿天然物:AglA

天然物(natural product)是藥物開發的重要來源之一,其中以植物、微生物等為研究大宗,海生生物相較所受關注較少。自約 50 年前(1969)首支海洋天然物衍生物:Cytarabine(Ara-C, Cytosar-U®)抗癌藥核准上市後,相關研發進展並不多。除因高通量篩選技術、藥物設計等的崛起使天然化合物稍受冷落 [1],海生生物的採集與培養困難也是一大阻礙 [2]。然近年或許是先導藥物(drug lead)的發展不如預期,加之相關結構鑑定等技術發展,海洋天然物再次受到矚目。

自海綿 Agelas dendromorpha 分離出的 Agelastatin A(AglA)即是關注焦點之一,AglA 為溴化的生物鹼,他的特殊結構(圖一)吸引了各方注意,不但已成功合成,也發現其極具藥物開發潛能,具備包含抑制癌細胞生長、穿透血腦障壁等功能。然而其作用機制一直是未解之謎,以約翰霍普金斯大學為首的團隊著手研究 [3],逐步拆解分析,終於發現 AglA 是透過與核糖體結合而能抑制轉錄延長、蛋白質合成,進而具有細胞毒性,解決了懸宕 20 年的疑問,讓 AglA 朝藥物開發更進一步。

圖一、 Agelastatin A (AglA) 及其同類物(congeners)之化學結構。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

首先團隊想確定 AglA 究竟是作用在分生中心法則(central dogma):DNA 複製、轉錄、轉譯的哪一步驟,因此透過標定胸腺嘧啶([3H]thymidine)、尿嘧啶( [3H]uridine)、甲硫氨酸/半胱氨酸([35S]methionine/cysteine)的讀值分別代表 DNA、RNA、蛋白質的合成量,結果顯示在經 AglA 處理一小時後,標定的胸腺嘧啶與氨基酸含量下降(圖二A),但尿嘧啶的標定量並未有顯著改變,代表只有 DNA 複製與蛋白質合成受抑制。這個結果與已知能抑制轉譯延長的 cycloheximide (CHX)相似(圖二B),使得團隊猜測或許 AglA 也與轉譯有關。

圖二、Agl 與 CHX 處理會抑制 DNA 複製(標定胸腺嘧啶 [3H]thymidine 含量下降)與蛋白質合成(標定甲硫氨酸/半胱氨酸 [35S]methionine/cysteine 含量下降)。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

團隊接著設計不同實驗以了解 AglA 會影響轉譯的啟動或延長,發現 AglA 或許和 CHX 一樣抑制了轉譯的延長。團隊將 IRES 序列(internal ribosome entry site,內部核糖體進入位點)插入兩段 ORF(open reading frame,開放閱讀框)之中:果蠅冷光素酶(fruitfly luciferase) ORF 與海腎冷光素酶 (renilla luciferase)ORF,如此一來前者的轉譯啟動為一般路徑,需要 eIF4F 複合體辨認 5 端帽(5’ cap)以啟動核糖體組裝,但後者則透過 IRES 序列、不需 eIF4F 即可開始轉譯,因此後者不受轉譯啟動抑制劑影響。結果顯示 AglA 和 CHX 都會抑制兩段序列的轉譯,意即 AglA 並不是抑制轉譯啟動,或許是作用在其後的轉譯延長階段。

團隊接著在體外(in vitro)重建了酵母菌的轉譯,轉譯序列產物為一段 Met-Phe (methionine-phenylalanine,甲硫胺酸-苯丙胺酸)雙肽鏈(dipeptide),結果發現隨著 AglA 的濃度增加,Met 含量不變但 Met-Phe 含量減少(圖三),顯示 AglA 確實影響了肽鍵的生成。轉譯的延長需要 eIF1A 和核糖體,團隊發現 AglA 不影響需要 eIF1A 的GTP 水解,但會抑制需要核糖體的肽基-tRNA(peptidyl-tRNA)水解,且此反應與肽鍵生成類似。綜合這些結果,團隊認為肽鍵生成區域:核糖體的 PTC(peptidyl transferase center肽基轉移酶中心)為 AglA 在抑制轉譯延長的作用對象。

圖三、AglA 減少 Met-Phe 雙肽中肽鍵生成。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

那麼 AglA 確切會作用在核糖體 PTC 的哪些位點呢?為此,團隊將純化的酵母菌核糖體與 AglA 一同培養,再以 DMS (dimethyl sulfate)處理以使裸露的腺嘌呤(adenosine)、胞嘧啶(cytosine)甲基化,透過特殊的高通量定序技術 DMS-MapSeq 量化各位點甲基化程度,就能得知哪些位點可能因 AglA 的結合而受屏障保護,不因 DMS 處理而被甲基化。

DMS-MapSeq 顯示酵母菌 25S 大核糖體次單元中, PTC 區域內的 C2821 受到 AglA 的保護(圖四A、B),分子嵌合(molecular docking)模擬也預測 AglA 會與 PTC 區域結合,保護 C2821並和周圍的核苷酸產生氫鍵(圖四C)。

圖四、AglA 與核糖體 PTC 區域結合屏障 C2821。A、B為 DMS-MapSeq 結果,C 為分子嵌合模擬分析,虛線為氫鍵。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

最終團隊透過結晶(crystalization)解出 AglA 和酵母菌 80S 核糖體結合的結構,證實 AglA 會與 PTC 結合,結合位為大次單元體上的 A 區(A site)並與周遭許多核苷酸有交互作用。 AglA 的結合也會導致周遭區域的構型變化,如 U2875 向外翻轉出 PTC 結合區域、U2873的傾斜(圖五)。與其他已知與 PTC 結合的抑制劑相比較,有些構型變化相似如 U2873 的傾斜,然而如 U2875 的變化則較可能是因為 AglA 的特殊化學結構導致。

圖五、結晶結構顯示AglA 與核糖體結合導致之構型改變。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

本研究解開了 AglA 的作用機制,也分析出 AglA 與周遭核苷酸的交互作用,不僅能解釋先前其他研究觀察到的 AglA 及其相似物的構效關係(structure-activity relationship),也對後續藥物結構優化有所助益,有望加快 AglA 成為抗癌藥的開發進展。

 

參考文獻:

  1. Dyshlovoy, S. A., Honecker, F. (2020). Marine Compounds and Cancer: The First Two Decades of XXI Century. Marine Drugs, 18, 20. https://doi.org/10.3390/md18010020
  2. Molinski, T. F., Dalisay, D. S., Lievens, S. L., Saludes, J. P. (2009). Drug development from marine natural products. Nature Reviews Drug Discovery 8, 69–85. https://doi.org/10.1038/nrd2487
  3. McClary, B., Zinshteyn, B., Meyer, M., Jouanneau, M., Pellegrino, S., Yusupova, G., Schuller, A., Reyes, J. C., Lu, J., Guo, Z., Ayinde, S., Luo, C., Dang, Y., Romo, D., Yusupov, M., Green, R., & Liu, J. O. (2017). Inhibition of eukaryotic translation by the antitumor natural product Agelastatin a. Cell Chemical Biology, 24(5), 605-613.e5. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.04.006

撰文|黃云宣
審稿|張智婷

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黃云宣

TU Dresden 分子生物工程研究所學生,國立臺灣大學生化科技學系畢,研究領域為蛋白質化學、結構生物學。曾參與 2015 iGEM,曾任系學會系刊部長、生科院院學會秘書、臺大畢聯會公關部長。

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