由整合蛋白（ integrins ）形成的點狀黏著（ focal adhesion ）是細胞感知外在基質（ extra-cellular matrix ）尺度與機械性質的重要構造，影響細胞的貼附及移動。因此，細胞如何形成點狀黏著構造是細胞力學多年來熱門的研究主題。新加坡國立大學生物力學研究所的 Michael Sheetz 團隊利用鈦（ Ti ）及金鈀合金（ AuPd ）為基底，以電子束微影術（ e-beam lithography ）刻劃奈米尺度的陣列圖形，並在表修飾整合蛋白的配體（ ligand ） RGD 多肽（ Arg-Gly-Asp ），結合超解析顯微術（photoactivated localization microscopy，PALM），觀察纖維母細胞在接觸基質後 15 – 30 分鐘內所形成的點狀黏著。
研究團隊設計了不同線寬、不同間距的條紋狀陣列做為基質（圖一 a, b ），並以經過表面處理的一般玻片做為控制組，比較細胞在不同基質上形成的點狀黏著。其中，10 奈米寬的奈米線與生物體內 5 – 20 奈米的纖維狀基質尺度相仿，而線距 110 奈米則和整合蛋白叢集的大小相當。即使確保了 RGD 多肽在基質表面密度相當，當奈米線間距大於 110 奈米時，細胞在線寬為 10 奈米的單線條紋上延展面積明顯較小，細胞內部點狀黏著的平均面積也較小（圖一 c – f ），螢光標記樁蛋白（ paxillin-mApple ）周圍的黏著蛋白質叢集存在時間也較短。當線距介於 40 – 80 奈米之間形成成對條紋，或是模擬網狀纖維，夾角 25° 的菱形格紋作為基底時，細胞在同樣線寬的奈米線上明顯張得更開，形成更大面積的點狀黏著（圖一 e, f ）和更多的肌動蛋白應力纖維（ actin stress fibers ），點狀黏著訊息傳導路徑下游的磷酸化酪氨酸激脢（phosphorylated focal adhesion kinase，pFAK）活化程度也相當於控制組中的細胞（圖二）。
圖一：細胞與胞外基質形成點狀黏著，跨越奈米結構（ a ）以鈦金屬為基底的奈米結構電顯影像，由左至右分別為：線寬 10 奈米的交叉菱形格紋、平行線間距 490 奈米、夾角為 25° ；間距 490 奈米、線寬 10 奈米的平行線條紋；間距 240 奈米、線寬 10 奈米、單線；間距 150 奈米、線寬 10 奈米的成對雙線，兩對中心線間距為 330 奈米；間距 70 奈米、線寬 10 奈米的成對雙線，兩對間距 410 奈米；間距 40 奈米、線寬 10 奈米的成對雙線，兩對間距 440 奈米；間距為 460 奈米、線寬為 40 奈米的平行線條紋；( b ) 經過表面修飾的條紋陣列共軛焦影像，橘框內放大與上方（ a ）圖對應；（ c ）小鼠成纖維母細胞（mouse embryonic fibroblasts）在各對應奈米結構上延展過程中形成的樁蛋白顯微影像，白框內放大為（ d ）；（ e ）不同線寬、間距的奈米結構上細胞面積統計；（ f ）各結構上細胞形成點狀黏著面積與細胞面積相對大小。圖片來：Changede et al. Nat. Mater. (2019) DOI: 10.1038/s41563-019-0460-y
圖二：在各奈米結構上的細胞內磷酸化酪氨酸激脢免疫染色影像與統計。（ a ）由左而右分別為：六角點陣列、平行單線、成對雙線陣列，上下對應圖內白框放大為（ b ）；（ c ）在各對應的奈米結構上細胞內磷酸化酪氨酸激脢免疫染色影像；（ d ）各奈米結構上細胞的板狀偽足中磷酸化酪氨酸激脢叢集每單位面積數量，由左至右依序為：玻片- RGD 、六角點陣列 – RGD 、平行單線 – RGD 、成對雙線陣列 – RGD 、交叉菱形格紋- RGD 。圖片源：Changede et al. Nat. Mater. (2019) DOI: 10.1038/s41563-019-0460-y
然而，整合蛋白的大小才約 20 奈米，細胞是怎麼在成對奈米線上形成點狀黏著呢？研究團隊推測，活化的整合蛋白即使沒有和配體結合，也可以和有結合配體的整合蛋白叢集，形成橋梁跨越奈米鴻溝。研究結果也顯示，無法接上 RGD 配體但已活化的整合蛋白 β3 （ β3 D119YN305T 基因變體）仍和細胞內原生的整合蛋白 β3 及配體 RGD 位置部分重疊（圖三）。
圖三：（ a ）具 β3D119YN305T 的變體小鼠成纖維母細胞株在成對雙線- RGD 基底上的超解析顯微影像，此處結構兩線間距為 70 奈米、線寬 10 奈米，兩組平行線間距 410 奈米；（ b ）為（ ａ ）圖中縱切兩組平行線上整合蛋白 β3 和 RGD 的空間分布。圖片來源：Changede et al. Nat. Mater. (2019) DOI: 10.1038/s41563-019-0460-y
綜合以上觀察，間距小於 110 奈米的平行線條、菱形格紋或六角點陣等圖形陣列才能讓細胞形成類似在二維平面上的穩定點狀黏著和使細胞延展。而成對的線條陣列及整合蛋白 β3 變體細胞株的實驗結果則可能表示未上配體 RGD 的活化整合蛋白 β3 和接上配體的活化 β3 在訊息傳導路徑中成對活動，讓細胞在低配體濃度的極限環境中仍能保持靈活度。
參考文獻：
- Changede, R., Cai, H., Wind, S.J. et al. Integrin nanoclusters can bridge thin matrix fibres to form cell–matrix adhesions. Nat. Mater. 18, 1366–1375 (2019). DOI: 10.1038/s41563-019-0460-y
撰文｜林宛瑢
審稿｜周文鴻
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[…] at the nano-bio interface. Nature materials, 8(7), 543–557. https://doi.org/10.1038/nmat2442 [2] 整合蛋白跨越奈米鴻溝 [3] 環境中的「地形」可促使細胞移動 [4] […]