鏡相動作電位─利用微流道達成非侵入性光學電生理檢測方法

在電生理學（electrophysiology）的領域中，由生電細胞（electrogenic cells）產生的動作電位（action potentials）從神經生理學到心臟學、藥理學及其他醫學領域皆扮演著重要的角色，因此如何紀錄細胞的電生理變化一直是人類長期想要達成的目標。1970 年代德國科學家 Neher 和 Sakmann 開發出膜片鉗（patch clamp）技術，使用此技術紀錄離子通道的離子電流來反應細胞膜上離子通道的分子活動情形，並於 1991 年的諾貝爾生理醫學獎 [1]，越來越多的方法也被開發用來測量細胞的動作電位，例如：微電極陣列（microelectrode arrays, MEA）、互補式金屬氧化物半導體奈米電極陣列（complementary metal-oxide-semiconductor nanoelectrode array, CMOS-NEA） [2]、鈣離子影像紀錄（calcium imaging）、電壓感應光學（voltage-sensing optical, VSO）平台、阻抗頻譜（impedance spectroscopy），雖然這些技術彌補了膜片鉗的缺失且各有優點，然而也都存在著一些限制，例如進行需要複雜培養環境的神經元網絡或心臟融合細胞研究時，無法同時觀測大量的細胞，且目前已開發的技術中最大的缺陷則是對細胞的侵入性，電穿孔（electroporation）易造成數據再現性低且無法長時間觀察。

利用光學方法紀錄動作電位是一種常見紀錄動作電位的方式，當染劑分子（dye-molecules）與細胞結合後可以依膜電位的變化而激發出不同強度的光，這個方法不需要破壞細胞膜且具有高解析度也易於執行；然而染劑分子可能改變細胞內的分子機制而影響細胞活性甚至產生細胞毒性。也因為這些限制，新藥開發的過程中，臨床前的體外及動物試驗易引起誤導而造成大量臨床試驗的失敗，因此亟需開發出新的電生理量測方法。用在藥物篩選中最理想的電生理偵測方法須具備以下條件：不具侵入性或干擾性（不會產生膜穿孔或細胞毒性）、高解析度（可清楚觀察單一細胞或更局部）、可擴充性（同樣的培養環境中可同時察大量細胞）、大通量（可同時觀察多種不同培養條件的樣品）且易於自動化。

義大利科學家的研究團隊研發出一種新穎的量測動作電位的裝置，能夠克服以上提及的限制。這個方法是將電荷轉移到微流（microfluidic）通道中，藉由觀察鏡像電位（mirror charge）的改變，紀錄由細胞產生的動作電位：細胞（培養在  CIS-chamber）產的電位改變使電極導體產生電荷，進而影響虛擬鏡像細胞（virtual mirror cell, 呈現在 TRANS-chamber）中帶電螢光染劑的空間分佈（圖一），因應細胞的動作電位（action potential, AP）變化可以在虛擬鏡像細胞產生相對應的鏡像動作電位（mirror action potential, MAP），帶電的螢光染劑會表現出不同的光學強度（圖二）。這兩個槽（chamber）是完全分離的，培養的細胞完全不會與螢光染劑有任何接觸，因此這方法在本質上是不具侵入性的。

此團隊進一步選用多功能幹細胞（human-induced pluripotent stem cell, hiPSC）誘導分化的心肌細胞來證明此裝置檢測生電細胞產生之動作電位的能力，在開始測量動作電位前先測試細胞的存活率並使用免疫螢光染色評估心肌細胞是否達到最佳的成熟階段，結果顯示在此裝置持續培養七天後心肌細胞存活率仍維持 90% 以上，免疫共染心臟肌鈣蛋白 T（troponin T，標記成熟心肌細胞）和 NKX2-5（標記早期心臟中胚層細胞）的結果顯示細胞大量表現成熟心肌細胞的肌鈣蛋白，故此裝置不影響心肌細胞的發育（圖三 a）。經過一段時間培養，單層細胞遍布在此裝置且能夠自主跳動，相機偵測到螢光強度有規律的震盪，具有固定的重複率和較高的訊號雜訊比（signal to noise ratio, SNR），這些螢光的變化是鏡像動作電位（圖三 b）。此團隊也觀察了細胞給予 Nifedipine（鈣離子通道子阻斷劑）後的動作電位變化，在給予 Nifedipine 後心肌細胞提高了收縮的頻率（圖四），鏡像電位速率從 0.65 提高到 0.85 赫茲。

這個新的方法具有潛力可以取代當前使用的 MEA 和 VSO 方法測量藥物對心肌細胞的毒性，而菌類因細胞較小而導致 MEA 和膜片鉗使用起來較為困難，因此鏡像動作電位也可以應用在菌類及生物膜（biofilms）。此裝置的長期生物相容性以及不同細胞在此裝置上的貼附能力仍需再進一步研究，但是鏡像動作電位的觀念確實為電生理學領域立下了一個很重要的里程碑。

參考文獻：

[1] Annecchino, L. A., & Schultz, S. R. (2018). Progress in automating patch clamp cellular physiology. Brain and neuroscience advances, 2, 2398212818776561. https://doi.org/10.1177/2398212818776561

[2] Abbott, J., Ye, T., Qin, L., Jorgolli, M., Gertner, R. S., Ham, D., & Park, H. (2017). CMOS nanoelectrode array for all-electrical intracellular electrophysiological imaging. Nature nanotechnology, 12(5), 460–466. https://doi.org/10.1038/nnano.2017.3

[3] Barbaglia, A., Dipalo, M., Melle, G., Iachetta, G., Deleye, L., Hubarevich, A., Toma, A., Tantussi, F., & De Angelis, F. (2021). Mirroring Action Potentials: Label-Free, Accurate, and Noninvasive Electrophysiological Recordings of Human-Derived Cardiomyocytes. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.), 33(7), e2004234. https://doi.org/10.1002/adma.202004234

 

撰文｜張智婷
審稿｜蔡京庭