CMOS奈米電極陣列-高通量神經網絡細胞內電生理紀錄方法

“What mazes there are in this world. The branches of trees, the filigree of roots, the matrix of crystals…None more complicated than the human brain, what may be the most complex object in existence; one wet kilogram within which spin universes.”

–Anthony Doerr, All the Light We Cannot See

神經元如何透過電生理訊號傳遞並整合訊息，始終是科學家試圖深究的問題。人類大腦平均含有約 1200 億個神經元，這些細胞頻繁地透過神經突起接收並傳送訊息。神經元樹突所接收的化學或電訊號會在細胞膜表面產生電壓變化，並傳送到細胞本體；當此電壓變化超過閾值，便會產生動作電位（action potential, AP），透過軸突傳遞至下一個神經元的樹突。這些神經元所傳遞的訊號經歷匯聚、發散、與同步後，交織構成思想、情緒、與各種行為或反應。

科學家目前主要利用電極偵測並記錄這些電生理訊號，其中於 1970 年代發展出的膜片鉗（patch clamp）電極，則是利用包覆在細玻璃管中的電極穿透神經元表面，不僅能夠偵測動作電位，也可記錄細胞中如突觸後電位（postsynaptic potential, PSP）等細微的訊號。這項技術雖然為神經生物學帶來了重大的變革，卻僅能同時量測數個細胞的訊號，難以記錄整個神經網路的活動。近年來，科學家致力於發展能夠針對大型神經網路細胞內電生理訊號進行平行紀錄的方式 [1][2]。然而，膜片鉗電極不易組裝為稠密陣列進行大量的量測工作，而且需仰賴高度的實驗操作技巧。反之，過去發表的奈米電極陣列，雖著眼於平行記錄，細胞內介面的訊息保真度卻仍然不及膜片鉗電極，不適合記錄神經網路繁複的電生理訊號 [2][3][4]。

來自哈佛大學的研究團隊 [5] 開發出了一個能高度靈敏地偵測細胞內訊號的電子晶片（圖一），可同時記錄來自上千個相聯的神經元的訊息。團隊利用與電腦微型處理器相同的製造技術研發出CMOS神經電子介面器械(CMOS neuroelectronic interface, CNEI)，結合互補式金屬氧化物半導體（complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS）晶片與 4096 個由垂直的奈米鉑黑（platinum-black, PtB）電極組成的記錄─刺激位點（或也稱「像素」）；換言之，即是帶有 4096 個微觀訊號放大器的單片積體電路（monolithically integrated circuit）。

團隊將神經元直接培養於晶片上，底層高精準度的積體電路透過表面的奈米電極將電流傳遞到每個耦合的神經元上，使細胞膜表面產生暫時性的孔洞，並藉此量測到細胞內部的訊號。同時，電路也會增強電極由神經元內部偵測到的電壓訊號。奈米鉑黑電極電極表面的鉑粉鍍層，可提升接觸表面積並降低阻抗，並增進電生理訊號傳遞效率與訊號量測的靈敏度，此外，其表面質地也有利於電極與細胞膜密合。透過電流注射，電極可配置為擬態電流鉗（pseudocurrent-clamp, pCC）或擬態電壓鉗（pseudovoltage-clamp, pVC），穩定且靈敏地記錄神經細胞內的電生理訊號（圖二）；前者可量測動作電位與閾下膜電位，後者則可記錄離子通道電流，各個像素也能並行地刺激神經元。此外，團隊也透過離子通道藥物測試，發現將 pVC 配置電極應用於篩選離子通道藥物的潛力。

團隊透過實驗驗證 CNEI 上的單一像素可穩定地記錄閾下 PSPs 及離子通道電流，結果與膜片鉗技術相似，然而 CNEI 與膜片鉗技術最關鍵的差異在其高通量量測，CNEI 可以平行且高度保真地量測一個神經網絡內不同神經元的細胞內電生理訊號。團隊將電極進行 pCC 配置，藉由週期性地刺激神經網路，誘導神經元活動增加。CNEI 中 pCC 配置的電極除了可同時量測多個神經元的閾下膜電位，亦可定位並鑑定神經網路中的突觸連結與其他訊息傳導途徑。團隊透過全神經網路刺激，發現了成對相聯的神經元：在任何像素上施加電流脈衝時，這兩個神經元都會產生動作電位，此外，緊鄰的興奮性突觸後電位（EPSPs）會累積成為動作電位，顯示兩者間具有化學性突觸的連結。團隊也繪製出整個陣列所量測得的突觸連結定位（圖三），展示了平行記錄電生理訊號的特性，利用任一像素上的動作電位作為平均其他 4095 個像素訊號與偵測標的像素的觸發因子。若偵測到時間上相近的 PSPs，則可能意味著該像素與標的像素之間具有突觸連結。團隊由電子晶片的電極陣列，於 19 分鐘內紀錄了超過 1700 個大鼠神經元的細胞內電生理訊號，並鑑測超過 300 個突觸連結。

這個晶片結合了高靈敏度與平行處理的特性，對於建構功能性聯結體（connectome）與篩選高通量電生理訊號等研究大有裨益。此外，藉由平行記錄細胞內的訊號，勾勒出神經突觸網路，更為未來建構次世代人工神經網路（artificial neural network，ANN）與仿神經型態處理器（neuromorphic processors）的機器智慧提供發展策略。團隊也在此研究中利用這個高通量、高度精準的晶片，量測藥物對於大鼠神經網路中的突觸連結所產生的作用，期望未來發展出可針對神經性疾病與成癮作用進行高通量的藥物篩選的晶圓級系統（wafer-scale system）。

參考文獻：

[1] Jäckel, D., Bakkum, D. J., Russell, T. L., Müller, J., Radivojevic, M., Frey, U., …Hierlemann, A. (2017). Combination of High-density Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings to Enable Studies of Multisynaptic Integration. Scientific Reports, 7(1), 978. https://doi.org/10.1038/s41598-017-00981-4

[2] Abbott, J., Ye, T., Qin, L., Jorgolli, M., Gertner, R. S., Ham, D., &Park, H. (2017). CMOS nanoelectrode array for all-electrical intracellular electrophysiological imaging. Nature Nanotechnology, 12(5), 460–466. https://doi.org/10.1038/nnano.2017.3

[3] Robinson, J. T. et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. (2012). Nature Nanotechnology, 7, 180–184. https://doi.org/10.1038/nnano.2011.249

[4] Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y. & Cui, B. (2012). Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology, 7, 185–190 https://doi.org/10.1038/nnano.2012.8

[5] Abbott, J., Ye, T., Krenek, K., Gertner, R. S., Ban, S., Kim, Y., …Ham, D. (2020). A nanoelectrode array for obtaining intracellular recordings from thousands of connected neurons. Nature Biomedical Engineering, 4(2), 232–241.  https://doi.org/10.1038/s41551-019-0455-7

延伸閱讀｜神經科學與人工智慧攜手共舞的新世代

Investigator 選文｜Nanotechnology: new opportunities for the development of patch‐clamps

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撰文｜陳品萱
審稿｜蔡京庭