網狀超柔性電極—活體小鼠視網膜神經長期電生理紀錄方法

眼睛是人類的靈魂之窗，帶我們看見了世界的色彩及光亮，而其中視網膜（retina）扮演了將光轉化成神經訊號的功能，了解視網膜如何接受視覺影像並將訊息傳送到大腦，為中樞神經系統（CNS）處理信息迴路提供了一個良好的模型。視網膜中的視桿和視錐細胞（rods and cones）接收來自外界的視覺信號，將訊號透過中間神經元傳遞給視網膜神經細胞（rentinal ganglion cell, RGC），而 RGC 透過視神經，將訊號發送到大腦的視覺區域。為了瞭解 RGC 以提供更好的視覺神經迴路模型，記錄其電生理活動成為了一個常用手段，然而，目前 RGC 的活動主要仍仰賴離體電生理紀錄及鈣離子指示劑成像，這樣的方法對於了解視覺模型提供了幾個方面的限制。首先，神經元的彼此調節、荷爾蒙環境改變、及晝夜的節律變化等系統效應很難透過體外研究，離體的紀錄時間最多幾小時，難以觀察到神經可塑性（neural plasticity）的現象。再者，體外記錄方式根據方法不同，可能也會對細胞造成損害而無法做長期的系統性研究，最後，桿狀細胞（rods）在生長過程中依賴視網膜色素上皮層（retinal pigment epithelium, RPE），而這層細胞往往在分離神經細胞的過程中會遭受破壞，因此桿狀細胞的體外研究至今仍十分具有挑戰性。

為了克服體外研究帶來的一些挑戰性，本篇研究針對小鼠活體開發了長期的電生理紀錄方法，其方法仰賴植入性的電極紀錄電生理活動。然而，電極的植入材料對於生物可相容性有重大影響，傳統的電極使用較硬的材質（比如：矽、金屬、玻璃）插入腦組織中會引發慢性的免疫反應，造成較多神經元的受損，而原因來自於腦組織結構與植入性設備的材料楊氏係數（Young’s modulus）的差異性，大腦對於硬度差異太多的材料，會展現出比較差的生長性，導致腦組織與電極接觸介面出現細胞壞死的現象。為了克服此困難，本篇研究利用了超柔性材料設計出了網狀電極，其網狀的設計為電極的伸縮性提供了彈性，而電擊的材料選用 SU-8 ，是一種環氧基聚合物材料，此材料的硬度是相當於腦組織的（圖一），在液體溶液中更類似於膠體（圖二, I），為本實驗的電生理紀錄提供了很好的電生理相容性。藉由此設計，研究團隊製造出了網狀柔性電極，並利用立體定位手術注射的技術此入老鼠腦中（圖二, II, III）。除此以外，網狀電子設備每一個電極的尺寸都小於一顆神經本體（soma）的大小，因此可以精準紀錄單顆神經元的神經活動。

圖一、比較不同神經探針的材質硬度及尺寸，理想的硬度及尺寸應相似或小於腦組織。圖片來源：doi: 10.1016/j.conb.2017.11.007.

(I) 綠色箭頭指的是數個漂浮在食鹽水溶液的網狀電子設備，類似於膠體物質。(II) 網狀電子設備在液體中能明顯地展開。(III) 注射網狀電子設備可利用立體定位手術。圖片來源：doi: 10.1016/j.conb.2017.11.007.

本團隊利用此網狀電子設備，紀錄視網膜上的神經節細胞（rentinal ganglion cell, RGC），並提供過去沒有的研究成果，柔性電極因為其結構設計上的彈性，可以很好適應視網膜的結構曲率（圖三），研究團隊設計了具有 16 個通道的電子探針，均勻分布在 1.5 mm x 0.8 mm 平行四邊形的區域中，利用 SU-8 封裝金屬電極並且與外部放大器連接，在小鼠清醒狀況下提供了長期穩定的電生理紀錄狀況。

圖三、(A) 非同軸注射方法，針的橫向運動同步於視網膜取曲率，藍色與紅色點線分別代表注射針頭與網狀設備頂端移動的軌跡，使此網狀柔性設備能覆蓋於視網膜表面。 (B) 注射電子網狀設備第0天及第14天活體透視圖。圖片來源: doi: 10.1126/science.aas9160

超柔性網狀電極能長期穩定的覆蓋在視網膜上，不影響老鼠的視力

研究人員將網狀柔性電子設備注射視網膜上，每個紀錄電極（以綠色箭頭代表）分別連接到外部紀錄儀器（紅色代表 input/output pad），在注射入眼睛後，能覆蓋整個視網膜。實驗證實此設備能與視網膜行長期穩定的介面。此外，注射此網狀柔性電子設備（mesh electronics）並不會影響視網膜神經節細胞（RGC）的生長。研究人員也測試老鼠眼睛上有此設備是否造成視力受損，引此做了三種測試 – 瞳孔收縮、視動反射（optokinetic reflex, OKR）及視覺敏銳度都與正常老鼠無異，說明此設備並沒有影響老鼠的視覺功能（圖四）。

(A)- (B) 16 通道的網狀電極可以精準記錄單顆神經元活動 (single-neuron activity) 。(C)- (D) 利用棘波分類( spike sorting) 的方式，可以發現RGC分別在light ON/OFF 有兩種不同的放電模式 (firing pattern)，Ch2 及 Ch8 的RGC 可分別視為ON/ OFF RGC。圖片來源：doi: 10.1126/science.aas9160

利用此網狀柔性電子設備可分出對不同方向選擇性的 RGC 細胞

接下來，團隊為了評估可檢測到 RGC 類型的範圍，設計了移動性的光柵來刺激老鼠的視網膜，在圖四中，展現了紅藍綠三種代表性神經元在光柵刺激下的放電模式、放電頻率及方向及座標圖、以及訊號的疊加波峰模型，而根據極座標圖表我們也可以看出三種 RGC 細胞的分類：紅色感光神經元具有鼻-颞（Nasal→Temporal）偏好的訊號傳遞性，綠色感光細胞對訊號傳遞沒有方向偏好性，而藍色感光細胞具有腹到背側的（Dorsal→Ventral）的方向偏好性，而這樣的偏好性從注射後第 7 天到第 14 天保持著統計學上不顯著的微小變化，代表了此觀察的穩定性。

圖四、三個 RGC在光柵刺激下的放電模式（左），極座標圖（中）（Dorsal(D), Ventral(V), Nasal(N), Temporal(T)代表眼球中的四個方位）和疊加尖峰波形（右）。粉紅色陰影區相對於光柵在螢幕顯示的時間，光柵的移動方向於底部箭頭表示。來源：doi: 10.1126/science.aas9160

研究視網膜節細胞（RGC）的神經活動如何受晝夜節律調節

最後，團隊想知道是否能利用網狀電子設備來研究 RGC 在晝夜節律下是如何改變神經活動。團隊以每 4個小時為一個區間，紀錄 RGC 在光/ 暗循環中如何改變神經活動。結果發現此設備能成功紀錄單顆 RGC 在日夜週期的神經活動，而有些 RGC 在日間有較高的放電頻率（圖五B），有些則在夜間有較高的放電頻率（圖五C）。

圖五、(I) 同一個神經節細胞在三個完整的日夜週期下 (Day 1-2, 4-5, 6-7) 的神經放電頻率。(II) 同一顆神經節細胞在三個日夜週期下的平均放電頻率。圖片來源： doi: 10.1126/science.aas9160

在本篇研究中，利用柔性材料的選擇及網狀電極的設計，結合了同軸注射的方法，成功量測了清醒小鼠中不同類型 RGC 長期穩定的電生理紀錄，而因為此方法擁有極佳的生物相容性，將來也有機會運用到更大型的生物甚至是人類身上，此方法為將來研究活體視網膜神經細胞提供一個具吸引力的研究方法。

參考文獻：

Hong, G., Fu, T., Qiao, M., Viveros, R., Yang, X., & Zhou, T. et al. (2018). A method for single-neuron chronic recording from the retina in awake mice. Science, 360(6396), 1447-1451. doi: 10.1126/science.aas9160

Hong, G., Yang, X., Zhou, T., & Lieber, C. M. (2018). Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current opinion in neurobiology, 50, 33–41. https://doi.org/10.1016/j.conb.2017.11.007

撰文｜彭顗睿
審稿｜蔡京庭