在疾病的分子機制、訊息傳導路徑中存在著許多蛋白互相影響調控，彼此間的蛋白交互作用（PPI，protein-protein interaction）極為普遍也至關重要，因此使其成為熱門治療標靶之一。阻斷蛋白交互作用不只能更直接的影響目標蛋白的生物功能，也可能透過異位效應（allosteric effect），使目標蛋白其他區域的結構受影響而改變，進而導致生物活性降低 [1]。
然而，蛋白交互作用形成的蛋白複合體（protein complex）較個別蛋白更難以透過純化、結晶取得完整結構，預測上同樣因複雜的交互作用而仍是一大難題，使需要精準結構資訊的結構藥物開發法（註1）難有用武之地。為此，美國國家衛生院的研究團隊以交聯質譜儀（CLMS，cross linking mass spectrometry）與分子模擬（molecular modeling）建立了藥物開發系統，針對與癢覺傳遞有關的 R7BP 蛋白，模擬其結構與蛋白交互作用，並初步設計出抗體 [2]。
相較於結晶和電顯技術需要完整的目標蛋白以解析結構，CLMS 是以片段肽鏈資訊重組成蛋白整體結構。CLMS 主要利用交聯劑（crosslinker）將目標蛋白內或蛋白複合體之間，因互相作用而彼此靠近的區域連結固定，爾後加入蛋白酶將目標蛋白打斷成許多肽鏈、透過高效液相層析（HPLC，high performance liquid chromotography）分離肽鏈，最後分析各片段的質譜圖譜、鑑定出被交聯劑固定的區域（即蛋白交互作用區），進而重建出可能結構（圖一）。
圖一、交聯質譜儀於結構生物學上的運用流程。（Kalathiya, U., et al. Biomolecules 2021, DOI:10.3390/biom11030382）
先前研究顯示 R7BP 及 R7-RGS（Regulator of G-protein signaling)/Gβ5 複合體兩者的結合與癢覺傳遞有關 [3]，而搔癢（pruitus）是諸多疾病的症狀之一，如膽汁積鬱（cholestatic）相關的肝病、尿毒症（uremia）、神經病變（neuropathies）及皮膚病症等。因此，若能阻斷 R7BP 與 R7-RGS/Gβ5 複合體的結合，或有可能發展為一新療法。然而 R7BP 本身結構尚未能透過結晶或電顯技術解出，R7-RGS/Gβ5 的結構亦有部分區域未解 [4]，因此本研究嘗試以 CLMS 著手，試圖找出 R7BP 和 R7-RGS/Gβ5 蛋白複合體中的交互作用位置、結構資訊（圖二），並進行後續結構模擬與抗體設計。
圖二、R7BP/R7-RGS（以 RGS7 為例）/Gβ5 蛋白複合體結構。紅色虛線表示透過 CLMS 鑑定出的作用位。（Adikaram, P.R., et al. Commun Biol 2, 338 (2019). DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1）
本研究透過 CLMS 取得的結構資訊，結合團隊開發的 I-TASSER 分子模擬方法，反覆優化後最終建立出 R7BP 及 R7BP/R7-RGS/Gβ5 複合體的模擬結構，除了初步印證先前研究提出的交互作用蛋白域（domain）、鑑定出可能的作用位點，也依據結構成功設計出能干擾 R7BP/R7-RGS/Gβ5 複合體形成的抗體。
R7-RGS 家族中有許多結構相近的同源蛋白：RGS 6, 7, 9 與 11 ，從模擬結構中發現 R7BP N 端長 21 個氨基酸的片段與 RGS7 特有的 loop 結構有交互作用，且敲除該片段的 R7BP 不僅和 RGS7/Gβ5 有更高的結合傾向（但與其他 R7-RGS 蛋白的結合無顯著影響）（圖三），沈降試驗中（pull down assay）也能降低正常 R7BP 與 RGS7/Gβ5 的結合傾向，顯示這或許能成為結合抑制劑的開發方向之一。
圖三、R7BP 與 RGS/Gβ5 的結合傾向分析，解離常數（KD，dissocation constant）越低代表結合傾向越高。R7BP-FL: 全長R7BP，R7BPΔN：缺少 N 端 21 個氨基酸的 R7BP ，R7BPΔC：缺少 C 端 34 個氨基酸的 R7BP，R7BPΔNC：同時缺少 N 端 21 個氨基酸、C 端 34 個氨基酸的 R7BP。（Adikaram, P.R., et al. Commun Biol 2, 338 (2019). DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1）
本研究初步顯示了 CLMS 與分子模擬工具的聯用能提供切實的結構預測，有助於後續抗體設計及蛋白網絡（protein network）的研究，惟後續生物功能試驗尚待執行，以驗證抗體藥物、抑制劑的有效性。
註1：結構藥物開發法（structure-based drug discovery）為電腦輔助藥物設計（computer-aided drug design）的方法之一，將目標蛋白與小分子化合物的結構互相嵌合，篩選出具較好結合能力的候選化合物。
參考文獻：
- Lee G. M., Craik C. S. Trapping moving targets with small molecules, Science, 2009, vol. 324 (pg. 213-215) DOI: 10.1126/science.1169378
- Adikaram, P.R., Zhang, JH., Kittock, C.M. et al. Development of R7BP inhibitors through cross-linking coupled mass spectrometry and integrated modeling. Commun Biol 2, 338 (2019). DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1
- Pandey, M., Zhang, J., Mishra, S. K., Adikaram, P. R., Harris, B., Kahler, J. F., Loshakov, A., Sholevar, R., Genis, A., Kittock, C., Kabat, J., Ganesan, S., Neubig, R. R., Hoon, M. A., & Simonds, W. F. (2017). A central role for R7bp in the regulation of itch sensation. Pain, 158(5), 931-944. DOI: 10.1097/j.pain.0000000000000860
- Patil, D. N. et al. Structural organization of a major neuronal G protein regulator, the RGS7-Gbeta5-R7BP complex. Elife 7, e42150 (2018). DOI: 10.7554/eLife.42150
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