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質譜儀也能解蛋白質結構?——交聯質譜儀輔助結構藥物開發

在疾病的分子機制、訊息傳導路徑中存在著許多蛋白互相影響調控,彼此間的蛋白交互作用(PPI,protein-protein interaction)極為普遍也至關重要,因此使其成為熱門治療標靶之一。阻斷蛋白交互作用不只能更直接的影響目標蛋白的生物功能,也可能透過異位效應(allosteric effect),使目標蛋白其他區域的結構受影響而改變,進而導致生物活性降低 [1]。

然而,蛋白交互作用形成的蛋白複合體(protein complex)較個別蛋白更難以透過純化、結晶取得完整結構,預測上同樣因複雜的交互作用而仍是一大難題,使需要精準結構資訊的結構藥物開發法(註1)難有用武之地。為此,美國國家衛生院的研究團隊以交聯質譜儀(CLMS,cross linking mass spectrometry)與分子模擬(molecular modeling)建立了藥物開發系統,針對與癢覺傳遞有關的 R7BP 蛋白,模擬其結構與蛋白交互作用,並初步設計出抗體 [2]。

相較於結晶和電顯技術需要完整的目標蛋白以解析結構,CLMS 是以片段肽鏈資訊重組成蛋白整體結構。CLMS 主要利用交聯劑(crosslinker)將目標蛋白內或蛋白複合體之間,因互相作用而彼此靠近的區域連結固定,爾後加入蛋白酶將目標蛋白打斷成許多肽鏈、透過高效液相層析(HPLC,high performance liquid chromotography)分離肽鏈,最後分析各片段的質譜圖譜、鑑定出被交聯劑固定的區域(即蛋白交互作用區),進而重建出可能結構(圖一)。

圖一、交聯質譜儀於結構生物學上的運用流程。(Kalathiya, U., et al. Biomolecules 2021, DOI:10.3390/biom11030382)

先前研究顯示 R7BP 及 R7-RGS(Regulator of G-protein signaling)/Gβ5 複合體兩者的結合與癢覺傳遞有關 [3],而搔癢(pruitus)是諸多疾病的症狀之一,如膽汁積鬱(cholestatic)相關的肝病、尿毒症(uremia)、神經病變(neuropathies)及皮膚病症等。因此,若能阻斷 R7BP 與 R7-RGS/Gβ5 複合體的結合,或有可能發展為一新療法。然而 R7BP 本身結構尚未能透過結晶或電顯技術解出,R7-RGS/Gβ5 的結構亦有部分區域未解 [4],因此本研究嘗試以 CLMS 著手,試圖找出 R7BP 和 R7-RGS/Gβ5 蛋白複合體中的交互作用位置、結構資訊(圖二),並進行後續結構模擬與抗體設計。

圖二、R7BP/R7-RGS(以 RGS7 為例)/Gβ5 蛋白複合體結構。紅色虛線表示透過 CLMS 鑑定出的作用位。(Adikaram, P.R., et al. Commun Biol 2, 338 (2019). DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1)

本研究透過 CLMS 取得的結構資訊,結合團隊開發的 I-TASSER 分子模擬方法,反覆優化後最終建立出 R7BP 及 R7BP/R7-RGS/Gβ5 複合體的模擬結構,除了初步印證先前研究提出的交互作用蛋白域(domain)、鑑定出可能的作用位點,也依據結構成功設計出能干擾 R7BP/R7-RGS/Gβ5 複合體形成的抗體。

R7-RGS 家族中有許多結構相近的同源蛋白:RGS 6, 7, 9 與 11 ,從模擬結構中發現 R7BP N 端長 21 個氨基酸的片段與 RGS7 特有的 loop 結構有交互作用,且敲除該片段的 R7BP 不僅和 RGS7/Gβ5 有更高的結合傾向(但與其他 R7-RGS 蛋白的結合無顯著影響)(圖三),沈降試驗中(pull down assay)也能降低正常 R7BP 與 RGS7/Gβ5 的結合傾向,顯示這或許能成為結合抑制劑的開發方向之一。

圖三、R7BP 與 RGS/Gβ5 的結合傾向分析,解離常數(KD,dissocation constant)越低代表結合傾向越高。R7BP-FL: 全長R7BP,R7BPΔN:缺少 N 端 21 個氨基酸的 R7BP ,R7BPΔC:缺少 C 端 34 個氨基酸的 R7BP,R7BPΔNC:同時缺少 N 端 21 個氨基酸、C 端 34 個氨基酸的 R7BP。(Adikaram, P.R., et al. Commun Biol 2, 338 (2019). DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1)

本研究初步顯示了 CLMS 與分子模擬工具的聯用能提供切實的結構預測,有助於後續抗體設計及蛋白網絡(protein network)的研究,惟後續生物功能試驗尚待執行,以驗證抗體藥物、抑制劑的有效性。

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註1:結構藥物開發法(structure-based drug discovery)為電腦輔助藥物設計(computer-aided drug design)的方法之一,將目標蛋白與小分子化合物的結構互相嵌合,篩選出具較好結合能力的候選化合物。

 

參考文獻:

  1. Lee G. M., Craik C. S. Trapping moving targets with small molecules, Science, 2009, vol. 324 (pg. 213-215) DOI: 10.1126/science.1169378
  2. Adikaram, P.R., Zhang, JH., Kittock, C.M. et al. Development of R7BP inhibitors through cross-linking coupled mass spectrometry and integrated modeling. Commun Biol 2, 338 (2019).  DOI: 10.1038/s42003-019-0585-1
  3. Pandey, M., Zhang, J., Mishra, S. K., Adikaram, P. R., Harris, B., Kahler, J. F., Loshakov, A., Sholevar, R., Genis, A., Kittock, C., Kabat, J., Ganesan, S., Neubig, R. R., Hoon, M. A., & Simonds, W. F. (2017). A central role for R7bp in the regulation of itch sensation. Pain, 158(5), 931-944.  DOI: 10.1097/j.pain.0000000000000860
  4. Patil, D. N. et al. Structural organization of a major neuronal G protein regulator, the RGS7-Gbeta5-R7BP complex. Elife 7, e42150 (2018). DOI: 10.7554/eLife.42150

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黃云宣

TU Dresden 分子生物工程研究所學生,國立臺灣大學生化科技學系畢,研究領域為蛋白質化學、結構生物學。曾參與 2015 iGEM,曾任系學會系刊部長、生科院院學會秘書、臺大畢聯會公關部長。

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