A 型流感病毒逃逸自噬作用的關鍵因子

病毒主要借用宿主細胞胞器及訊息傳導路徑完成複製並持續感染其他細胞，A 型流感病毒（IAV，Influenza A virus）亦不例外。目前 IAV 複製、致病的關鍵因子與機制已逐步釐清，然而針對 IAV 如何逃避細胞免疫，仍缺少較全面的體學分析。

當病毒入侵時，宿主自然不會任其肆虐。自噬作用（autophagy）即為一重要的防禦機制：宿主細胞中的自噬小體（autophagosome）會吞噬病原體，接著與溶酶體（lysosome）融合（fusion）、分解被包覆的病原體；然而另一方面，病毒同樣衍生出對應策略，如在前期阻礙自噬小體生合成，或在後期阻擋自噬小體與溶酶體的結合。

美國的 Sumit K. Chanda 團隊長期研究病毒感染過程中所表現的重要蛋白，今年（2021）稍早也曾發現 SARS-CoV-2 逃避細胞免疫的關鍵蛋白 [1]，近期其發表於 Nature Mircobiology 的研究則揭示了 A 型流感病毒逃逸自噬作用的機制 [2]。

本研究首先進行基因體規模的 siRNA 分析，比較 IAV 在經 siRNA 處理而剔除了不同基因的 THP-1 細胞¹中的感染力，因此辨識出 105 個與抗病毒相關的基因。加以與既有的功能試驗（loss-of-function assay）結果、IAV 感染之巨噬細胞的轉錄體（transcriptome）資料整合，透過 network propagation²方法，得出與限制 IAV 複製相關的生物路徑，諸如細胞週期、代謝、RNA 處理（RNA processing），此外也包含受 M2 蛋白調控的作用：內吞作用（endocytosis）、自噬作用與囊泡運輸等，參與這些路徑以限制 IAV 複製的基因便被稱為限制因子（restriction factor）。

¹THP-1 細胞：人類單核球細胞株，本研究採用的 THP-1 細胞株預先經分化處理成 THP-1 衍生人類巨噬細胞（THP-1 derived human macrophage）。

²network propagation：生物資訊學分析的一種方法，認為帶有相似表型的基因傾向互相作用，以此為核.  心概念出發，找出不同基因之間的作用關聯性 [3]。

IAV 表現的 M2 蛋白是一種離子通道蛋白，為 IAV 複製過程的重要蛋白，也會與宿主有交互作用而影響細胞恆定（homeostasis），過往研究亦發現與逃逸自噬作用有關 [4]，然 M2 蛋白作用的分子機制尚未明朗，因此團隊接著進行親和性純化質譜分析³（AP-MS，Affinity Purification Mass Sprectrometry）找出與 M2 蛋白結合的各蛋白，綜合基因體學資料，彙整出 M2 蛋白在不同生物路徑中與各宿主蛋白的作用網絡。

³AP-MS：聯用親和性管柱純化與質譜儀分析，以找出蛋白交互作用的方法。在細胞內穩定表現的目標蛋白首先經過親和性管柱純化（此時純化樣本中不只有單一目標蛋白，亦有該目標蛋白與胞內其他蛋白結合的複合體），接著以蛋白酶處理將蛋白水解為小片段胜肽，透過質譜儀分析定序胜肽片段，回推得樣本所含的蛋白種類，經運算分析篩選出真正與該目標蛋白有交互作用的標的。

在與病毒 M2 蛋白有交互作用的限制因子中，同樣也調控自噬作用的 TBC1D5 蛋白吸引了團隊注意， TBC1D5 能活化 Rab7 （調控自噬作用的一種 GTP 水解酶），以促進自噬小體與溶酶體的結合、啟動溶酶體對病毒的降解。因此團隊猜想，病毒或許會透過 M2 蛋白，與宿主的 TBC1D5、Rab7 在自噬作用過程中進行攻防，此即為本研究的下一焦點。

首先是對 TBC1D5 功能與影響層面的探討，體外試驗、小鼠模型中皆驗證了 TBC1D5 會抑制 IAV 增長，且 TBC1D5 的基因剔除會使自噬小體與溶酶體無法融合（但不影響病毒複製週期中的其他步驟，如病毒入侵、基因體複製與轉錄等），並增加 IAV 感染細胞中的 M2 蛋白含量，顯示宿主 TBC1D5 蛋白透過促進溶酶體降解，致使病毒 M2 蛋白含量降低。

那麼 TBC1D5 、Rab7、 M2 之間又有什麼樣的交互作用呢？團隊發現在 IAV感染細胞中， TBC1D5 與 Rab7 的交互作用減少，且活化的 Rab7 含量降低，然而若是受帶有 M2 基因缺陷的 IAV 感染，兩者的交互作用與活化的 Rab7 含量卻與未感染細胞無顯著差異，顯示 M2 蛋白透過干擾 TBC1D5 與 Rab7 的交互作用，抑制 Rab7 的活化。

綜上觀察，團隊最後提出 IAV 利用 M2 蛋白逃逸自噬作用的機制： M2 蛋白干擾 TBC1D5 與 Rab7 的結合，抑制 Rab7 的活化，進而使溶酶體無法與自噬小體結合，讓 IAV 得以免受降解而能完成複製週期。

本研究不僅使用大規模基因體分析、整合各樣生物資訊學數據，提出了不同生物路徑中 IAV 與宿主限制因子抗衡的宏觀網絡，也針對單一 M2 蛋白加以深入研究，提出 IAV 逃逸自噬作用的一種機制，為解析 A 型流感病毒的感染機制提供更多值得探討的不同標的機轉。

參考文獻：

1. Martin-Sancho, L., Lewinski, M. K., Pache, L., et al. (2021). Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Molecular Cell, 81(12), 2656-2668.e8. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.04.008
2. Martin-Sancho, L., Tripathi, S., Rodriguez-Frandsen, A. et al. Restriction factor compendium for influenza A virus reveals a mechanism for evasion of autophagy. Nat Microbiol 6, 1319–1333 (2021). https://doi.org/10.1038/s41564-021-00964-2
3. Cowen, L., Ideker, T., Raphael, B. et al. Network propagation: a universal amplifier of genetic associations. Nat Rev Genet 18, 551–562 (2017). https://doi.org/10.1038/nrg.2017.38
4. Gannagé, M. et al. Matrix protein 2 of influenza A virus blocks autophagosome fusion with lysosomes. Cell Host Microbe 6, 367–380 (2009). 

關鍵字：influenza A virus, autophagosome, M2 protein

撰文｜黃云宣
審稿｜黃文彥