幹細胞 發育生物學 科學報導 細胞與發育生物學

流嬗與凝駐:以iETX模型探討胚胎發育過程

“It is not birth, marriage, or death, but gastrulation which is truly the most important time in your life.”
–Lewis Wolpert–

從受精卵發育為成熟的多細胞個體,需經歷多次有絲分裂增加細胞數目、擴增細胞質量與體積、並定義細胞極性(polarity)。胚胎經由各種生物因子調控,建立三個體軸(body axis patterning,分為前─後、腹─背、左─右),並在原腸胚形成(gastrulation)時經歷大規模的細胞遷移,分化出三個胚層。經歷神經系統發育(neurulation)、器官形成(organogenesis)等發育歷程後,則形成具有功能的各種組織與器官,逐漸分化出較為精細成熟的生物構造 [1] [2]。

圖一、小鼠由受精卵至成體之發育過程。受精卵經過多次卵裂,形成桑葚胚(morula),再進一步形成囊胚(blastocyst),分出內細胞群、滋胚層、與囊胚腔,著床於子宮內膜。胚胎經過體軸建立、胚層分化、與器官形成等過程後,成長為胎兒(fetus),並逐步勾勒出個體生理構造的藍圖。
圖片來源:Wolpert, L. (2015). Chapter 3: Vertebrate life cycles, experimental techniques & human development. In Principles of development.

小鼠胚胎發育主要仰賴上胚層(epiblast, EPI)、胚外外胚層(extra-embryonic ectoderm, ExE)、與內臟內胚層(visceral endoderm, VE)之間的交互作用,使胚胎由囊胚發育為卵柱(egg cylinder)的結構。先前研究 [3][4] 指出此過程間的型態變化(morphogenesis)受到細胞凋亡與整合素(integrin)訊息傳導之調控,改變細胞極性與構型,對於體腔形成(lumenogenesis)亦有關鍵的影響(圖二)。

圖二、小鼠胚胎著床時期發育階段之變化。囊胚形成後(胚胎發育 4.5 天,E4.5),EPI 於著床時受到基底膜所促進的整合素訊息傳導(E4.5 晚期至 E5.25),決定細胞的軸向。接下來細胞發生構型與位向變化,形成如玫瑰花瓣(rosette)的構造(E4.75 至 E5.0),中央則出現空腔,隨卵柱拉長而拓寬。基底膜決定了 EPI 結構的雛形,將其由對稱中空的球狀組織轉化為杯狀構造,並隨著空腔的擴增與 ExE 膜間空隙的拓展,形成初期的羊膜腔。至此,卵柱形成完畢(E5.5 至 E5.75)。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.023

許多研究嘗試透過幹細胞模式系統解析胚胎發育過程,然而其中機轉繁複,如何模擬各個胚胎發育時期成為一大挑戰。Magdalena Zernicka-Goetz 研究室以建立幹細胞體外培養模式探討發育機制,有頗為豐碩的成果。先前研究結合了胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)、滋胚層幹細胞(trophoblast stem cells, TSCs)、與胚外內胚層幹細胞(extraembryonic endoderm stem cells, XEN),建構類似於胚胎的結構,稱為 ETX 模型 [5]。然而,此系統卻較難觀察到如原腸胚形成等細緻複雜的發育事件,促使團隊進一步推展技術 [6]。

究竟如何才能在胚胎發育不斷變動的過程中,攫取關鍵片刻呢?

團隊首先注意到 XEN 細胞的發育潛能較低,過往研究亦指出表現 Gata4 與 Gata6 蛋白可誘導細胞轉往內胚層分化 [7],故嘗試於既有的 ESCs 細胞株中誘導 Gata4 基因短暫表現(稱為 CAG-tetOG4 ESCs),並透過細胞嵌合體聚集試驗(chimera aggregation assay)輔以細胞型態與蛋白表現之分析,初步驗證其分化潛能(圖三)。

圖三、於 ESCs 中短暫誘導 Gata4 表現可促使其分化為原始內胚層(primitive endoderm, PrEn)譜系細胞,並初步驗證了混合細胞聚合物中具有自我組織能力,且可形成與 VE 和 EPI 相似的結構,是胚胎發育過程的關鍵。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

為了深入了解 CAG-tetOG4 ESCs 是否可取代 XEN 細胞,團隊將其與野生型 CAG-GFP ESCs 及 TSCs 混合,並稱之為「誘導 ETX(induced ETX, iETX)胚胎」,發現細胞在五天內呈現出階段型的型態變化,且經細胞譜系標記分析亦測得高於 ETX 胚胎的細胞數。

團隊接續探討 iETX 是否能克服 ETX 難以發展出前端內臟內胚層(anterior visceral endoderm, AVE)的訊息中心(signaling center)之困境,於 E4─E5 檢測 AVE 典型蛋白標記(Cerl、Lefty1、Dkk1)的表現程度與分布,確認 iETX 可發展出具遷移能力的前端內臟內胚層(AVE);此外,觀察發現 TS/ES 交界處表現 Brachyury(Bry,調節體軸後側形成之轉錄因子),且大多位於 Cerl 表現的對側,顯示 iETX 胚胎定義出了前─後(anterior-posterior)的體軸關係。

上皮─間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是形成各個胚層與發展體軸過程中的要素之一;在小鼠原腸胚形成時,可見 EPI/ExE 交界處 Bry+ 細胞發生 EMT,並外移至 EPI 與 VE 之間,形成中胚層。透過縮時攝影追蹤 iETX 胚胎 E4 至 E6 的動態過程,亦觀察到相似的蛋白表現與型態變化,這是 iETX 最為關鍵的技術突破(圖四)。團隊探討為其後續的分化潛能,發現 iETX 細胞可由原線(primitive streak, PS)衍生出具多種來自中胚層及內胚層譜系且表現 AVE 標記的細胞;然而 iETX 胚胎發展至 E6 後便會喪失其卵柱狀的構造,為其發育之極限。

圖四、iETX 胚胎系統可觀察到原腸胚形成與 EMT 之現象。透過縮時攝影,觀察到後側 ES/TS 交界細胞型態由柱狀轉為圓形,且逐漸遷移至 ES 與 VE-like 細胞層之間;個體前側細胞則仍維持上皮細胞的型態。過程中,進行原腸胚形成的後側細胞層逐漸增厚, PS 的長度亦穩定增加。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

團隊透過單細胞定序 [8],比較 Day 4 的 ETX 及 iETX 和不同時期小鼠胚胎的發育潛能,發現 iETX 與 E5.5 的胚胎最為相像。此外,相較於 XEN 細胞,tetOG4 ESCs 所產生的內胚層細胞與實際的 VE 細胞更為近似,且表現出了一系列與 VE 特性、特化為 AVE、與原腸胚形成等相關之調節蛋白,這也顯示了 iETX 在分化潛能上的優勢。

本篇研究在 ESCs 中短暫表現 Gata4,誘導其成為 VE 前驅細胞,進而構建更為貼近著床後胚胎的幹細胞模式系統,並透過一系列鑑測探討其細胞命運決定(cell fate determination)及分化潛能,克服既有技術所遭遇的困境(圖五)。然而,目前 iETX 仍存在些許限制,未來仍需進一步釐清細胞生理調控機制,並評估更為適合的培養條件,以利拓展其於發育生物學研究之應用。

圖五、iETX 胚胎可模擬小鼠著床後胚胎之狀態,並具有形成前端內臟內胚層(AVE)、定義前後體軸、與原腸胚形成之潛能。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

參考文獻:

[1] Takaoka, K., & Hamada, H. (2012). Cell fate decisions and axis determination in the early mouse embryo. Development, 139(1), 3-14. https://doi.org/10.1242/dev.060095

[2] Arnold, S. J., & Robertson, E. J. (2009). Making a commitment: Cell lineage allocation and axis patterning in the early mouse embryo. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10(2), 91-103. https://doi.org/10.1038/nrm2618

[3] Bedzhov, I., & Zernicka-Goetz, M. (2014). Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell, 156(5), 1032-1044. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.023

[4] Christodoulou, N., Kyprianou, C., Weberling, A., Wang, R., Cui, G., Peng, G., Jing, N., & Zernicka-Goetz, M. (2018). Sequential formation and resolution of multiple rosettes drive embryo remodelling after implantation. Nature Cell Biology, 20(11), 1278-1289. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0211-3

[5] Sozen, B., Amadei, G., Cox, A., Wang, R., Na, E., Czukiewska, S., Chappell, L., Voet, T., Michel, G., Jing, N., Glover, D. M., & Zernicka-Goetz, M. (2018). Self-assembly of embryonic and two extra-embryonic stem cell types into gastrulating embryo-like structures. Nature Cell Biology, 20(8), 979-989. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0147-7

[6] Amadei, G., Lau, K. Y., De Jonghe, J., Gantner, C. W., Sozen, B., Chan, C., Zhu, M., Kyprianou, C., Hollfelder, F., & Zernicka-Goetz, M. (2021). Inducible stem-cell-Derived embryos capture mouse morphogenetic events in vitro. Developmental Cell, 56(3), 366-382.e9. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

[7] Mathew, B., Muñoz-Descalzo, S., Corujo-Simon, E., Schröter, C., Stelzer, E. H., & Fischer, S. C. (2019). Mouse ICM Organoids reveal three-dimensional cell fate clustering. Biophysical Journal, 116(1), 127-141. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.11.011

[8] Klein, A. M., Mazutis, L., Akartuna, I., Tallapragada, N., Veres, A., Li, V., Peshkin, L., Weitz, D. A., & Kirschner, M. W. (2015). Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell, 161(5), 1187–1201. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.044

撰文|陳品萱
審稿|藍冠鈞

About the author

陳 品萱

陳 品萱

慕尼黑大學博士生,主要研究興趣為人類遺傳學與基因體學,對於小兒先天與發展疾病的源起與遺傳背景格外好奇並持續探索中。國立陽明大學生命科學系暨基因體科學研究所五年一貫學程畢,曾參與 2015 iGEM,亦曾擔任職涯沙龍副召及營隊教學長。喜愛科學傳播與寫作,期盼在 Investigator 與來自不同領域的人們交流,共同學習與成長。

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