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建構理想之家──利用支架孔徑調節間質幹細胞的分化命運

人類的頭骨並非單一骨架,而是由 8 塊顱骨與 14 塊顏面骨組成,銜接顱骨的縫隙被稱為顱縫(cranial suture),其會隨出生後的發育過程逐漸癒合 [1]。顱縫間質是連接顱骨的結締組織,充斥著由神經脊(neural crest)與中胚層(mesoderm)衍生出的顱縫間質幹細胞(suture mesenchymal stem cell, SMSC),當顱縫間質中的幹細胞群分化異常時,便會發生顱縫線封閉過早的情形 [1] [2]。

顱縫線封閉過早症候群(craniosynostosis)是常見的發育缺陷疾病之一,會導致新生兒頭骨異常與畸形,嚴重者會引起發育遲緩、呼吸和神經系統功能障礙等併發症。目前臨床上主要透過手術矯正治療,故針對外科手術搭配的組織再生技術便顯得極為重要 [3]。本篇研究著重於生物材料的開發,以維持顱縫間質幹細胞的幹性(stemness),並借助支架的物理性質來調節幹細胞分化。

圖一、健康成人頭骨的頂視圖(左)與側視圖(右)
圖片說明:線處顯示頭骨當中的顱縫線,人類頭顱在剛出生時有 4 大縫隙,隨著出生後發育成長隨之閉合。
圖片來源:https://doi.org/10.4161/org.23307

圖二、顱縫間質示意圖
圖片說明:顱縫間質(紅色處)由顱縫間質幹細胞所組成,此區域充斥結締組織,提供顱骨幹細胞生長所需的微環境。兩側顱骨前緣由礦化的成骨細胞(osteoblast)組成,成熟的骨細胞(mature osteocyte)包埋於骨基質中。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769

本篇研究選用具備生物相容性的高分子—左旋乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)作為材料 [4],使左旋乳酸聚合形成三維的網狀結構,在特定條件下建構出不同尺寸的孔隙,分別是:大孔(large pore, 250-425 μm)、中孔(medium pore, 125-250 μm)與小孔(small pore, 63-125 μm)。在掃描式電子顯微鏡的分析結果中,可見支架中均勻分布相互連接的球形孔徑,有利於細胞於此結構當中遷移並進行物質運輸;在高倍鏡分析下顯示,支架具備一致大小的奈米纖維表面,有利於細胞的貼附與增殖。

圖三、三維支架孔徑型態圖
圖片說明:通過掃描電子顯微鏡分析由左旋乳酸製成的支架孔徑型態。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769

分析所生成支架材料的孔徑大小、孔徑分布與整體結構後,研究者由健康小鼠中分離出顱縫來源的間質幹細胞(suture mesenchymal stem cell , SMSC)與長骨骨髓來源的間質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell , BMSC),培養於三種不同孔徑大小的支架上,依序分析細胞的礦化能力、組織血管新生、以及基因表現。

體外培養 24 小時後以電子顯微鏡進行初步驗證,顯示二種間質幹細胞在三種大小的孔洞支架中皆分布良好;體外培養 24 小時後,將細胞支架植入小鼠的皮下組織進行體內培養,8 週後以茜素紅染色(Alizarin red staining)分析細胞的鈣化程度,實驗結果顯示 BMSC 具備最高的鈣化能力,且在大孔徑組別中,二種來源的間質幹細胞比其他孔隙的組別具備更顯著能力;反之,在小孔組別中鈣化的效果似乎受到了限制。另一方面,血管新生與胞外基質填充(extracellular matrix, ECM)是顱骨形成的先決條件,故研究者針對支架所促成的血管新生進行分析,可見在小孔徑支架的組別當中,在 4 週的體內培養雖能發生血管新生,然而血管新生的直徑與深度受到限制;反之在大孔徑的組別當中,在 4 週後可見成熟且分布完整的血管脈叢,且血管的直徑可隨著體內培養時間延長而增加,同時組織間充斥較成熟且完整的胞外基質。

圖四、細胞鈣化程度(上排)與血管新生程度(下排)定量圖
圖片說明:針對細胞鈣化程度以茜素紅染色(Alizarin Red Staining)並以強度進行定量;以血管內皮細胞的生物標記 CD31+ 進行免疫染色分析,統計血管的穿透深度(左)與直徑(中);以天狼星紅染色(Picro-Sirius Red Stain)鑑定組織中的膠原纖維(下排右),作為胞外基質定量。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769

最後針對體內培養二種間質幹細胞進行基因表達的分析,結果顯示在小孔徑的組別當中,幹細胞生物標記 Gli1 和 Col3 的表達明顯增加,同時可見成骨相關的基因表現有下降的趨勢。反之,針對大孔徑的組別當中,有關幹細胞特性的基因表現量是低的,但有關成熟細胞基質的生物標記 Col1、血管新生的生物標記 VEGF、以及骨分化生物標記 BSP 的表現量有顯著上升的情形,顯示出支架的孔徑會決定間質幹細胞分化與否的走向。

圖五、基因表達熱點圖
圖片說明:收取皮下培養的細胞支架並進行基因表達分析,將培養 4 週與 8 週的熱點圖以趨勢作彙整並呈現。
圖片來源:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769

總結來說,本篇研究指出支架的孔徑大小是影響幹細胞分化命運的關鍵因素。在小孔徑的支架中,有利於維持間質幹細胞的幹性,防止細胞過早進行骨分化發展;在大孔徑的支架中,該環境能夠有效促進胞外基質成熟、發展出穩健的血管,並促使間質幹細胞走向骨分化與鈣化的路徑。此研究著重於細胞與生物材料間的交互作用,提升組織工程學的實際應用潛力。至於針對顱縫線封閉過早症候群的臨床應用,仍需後續研究加以驗證,包括此疾病的遺傳性因素、個體中異常的訊息分子傳導等,分子生物層次的調控機制與支架中細胞的交互影響仍待評估與分析 [1][5]。

參考文獻:

[1] Senarath-Yapa, K., Chung, M. T., McArdle, A., Wong, V. W., Quarto, N., Longaker, M. T., & Wan, D. C. (2012). Craniosynostosis: molecular pathways and future pharmacologic therapy. Organogenesis, 8(4), 103–113. https://doi.org/10.4161/org.23307

[2] Katsianou, M. A., Adamopoulos, C., Vastardis, H., & Basdra, E. K. (2016). Signaling mechanisms implicated in cranial sutures pathophysiology: Craniosynostosis. BBA clinical, 6, 165–176. https://doi.org/10.1016/j.bbacli.2016.04.006

[3] Santos-Ruiz, L., Mowatt, D. J., Marguerie, A., Tukiainen, D., Kellomäki, M., Törmälä, P., Suokas, E., Arstila, H., Ashammakhi, N., & Ferretti, P. (2007). Potential use of craniosynostotic osteoprogenitors and bioactive scaffolds for bone engineering. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 1(3), 199–210. https://doi.org/10.1002/term.26

[4] Wei, G., & Ma, P. X. (2006). Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres. Journal of biomedical materials research. Part A, 78(2), 306–315. https://doi.org/10.1002/jbm.a.30704

[5] Stamnitz, S., & Klimczak, A. (2021). Mesenchymal Stem Cells, Bioactive Factors, and Scaffolds in Bone Repair: From Research Perspectives to Clinical Practice. Cells, 10(8), 1925. https://doi.org/10.3390/cells10081925

撰文|陳祈瀅
審稿|梁文

About the author

陳 祈瀅

陳 祈瀅

一位藏著文科魂的理科女子,2021年國立陽明大學基因體科學研究所碩士畢業,2020年國立政治大學生物科技管理學程學生,目前就職於新加坡科技研究局(A*STAR)。主要研究領域為分子內分泌學和癌症生物學,對於內分泌代謝與神經系統的交互作用格外感興趣,也熱衷探討科技與人文的相關議題。
生命是一種長期持續累積的過程,科學亦然,期盼在知識的洪流當中能留下一絲足跡。

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